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Einfluss der Temperatur auf die Selektivität HPLC: Vier Substanzen = vier Peaks?

Autor / Redakteur: Frank Steiner* & Katherine Lovejoy* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Erhöht man bei der HPLC die Temperatur, so wirkt sich dies auf verschiedene Parameter aus. An der Trennung von vier Konservierungsstoffen wird gezeigt, warum der Anwender nicht nur die Geschwindigkeit im Blick haben sollte, sondern auch die Selektivitäten der Analyten.

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Abb.1: Van’t Hoff Plot gemäß Gleichung 1 zur Trennung von 4 Konservierungsstoffen auf einer Thermo Scientific Acclaim RSLC Polar Advantage II Säule, betrieben mit einer 50/50 Mischung von wässriger 20 mM Natriumphosphat Lösung bei pH=7, und MeOH als mobiler Phase. Die Abbildung zeigt unten rechts die unzulängliche Trennung bei der sehr gebräuchlichen Temperatur von 40 °C, sowie in der Legende die Strukturformeln der Analyte.
Abb.1: Van’t Hoff Plot gemäß Gleichung 1 zur Trennung von 4 Konservierungsstoffen auf einer Thermo Scientific Acclaim RSLC Polar Advantage II Säule, betrieben mit einer 50/50 Mischung von wässriger 20 mM Natriumphosphat Lösung bei pH=7, und MeOH als mobiler Phase. Die Abbildung zeigt unten rechts die unzulängliche Trennung bei der sehr gebräuchlichen Temperatur von 40 °C, sowie in der Legende die Strukturformeln der Analyte.
(Bild: Thermo Fisher Scientific)

Die Thermostatisierung der Trennsäule wird zwar bei nahezu allen modernen und automatisierten HPLC-Geräten vorgenommen, dennoch steht die Säulentemperatur meist nicht als wichtiger Parameter im Fokus der Methodenentwicklung. In erster Linie wird die Temperaturerhöhung in der Praxis als ein Weg zur Senkung der Viskosität der mobilen Phase gesehen. Primäres Ziel ist es dabei, den Rückdruck der Säule bei einer bestimmten Flussrate zu senken. So eignet sich eine Erhöhung der Säulentemperatur dazu, die Kinetik in der HPLC zu beschleunigen. Das Prinzip ist, mit einer Erhöhung der Flussrate Trennungen schneller zu machen, dabei aber durch die geringere Viskosität stets bei moderatem Rückdruck der Säule zu bleiben.

Die Temperatur beeinflusst bekanntlich jedoch nicht nur die Geschwindigkeit von Prozessen, sondern auch die Lage von Gleichgewichten und somit in der Chromatographie auch die Retention von Substanzen. Dies kann durchaus in bestimmten Trennmethoden auch zu temperaturabhängigen Selektivitäten für verschiedene Analyte führen. Ein besonders prägnanter Fall soll hier grundlegend betrachtet werden.

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Prinzipiell beschreibt die van’t Hoff’sche Gleichung die Lage von Gleichgewichten und so lässt sich mit ihr gemäß Gleichung 1 der Retentionsfaktor k in Abhängigkeit von der Temperatur der Trennsäule beschreiben, wobei ΔH0 die Übergangsenthalpie des Analyten zwischen mobiler und stationärer Phase ist und ΔS0 die entsprechende Übergangsentropie sowie ß das Phasenverhältnis in der Trennsäule.

Gleichung 1
Gleichung 1
(Bild: Thermo Fisher Scientific)

Es ist leicht zu erkennen, dass die Auftragung von ln k gegen 1/T einen linearen Zusammenhang ergibt und sich somit die entsprechende Abhängigkeit eigentlich bereits mit zwei Messpunkten beschreiben lässt. Eine weiträumige Linearität besteht in der Praxis aber meist nur in guter Näherung, Abweichungen treten besonders in Fällen mit gemischten Retentionsmechanismen auf, wie sie in der HPLC jedoch sehr häufig vorkommen. Somit ist es zur etwas exakteren Bestimmung der entsprechenden Abhängigkeit ratsam, mindestens drei Messpunkte aufzunehmen. Weiterhin sollte auf Vorhersagen mittels Extrapolation auf Temperaturen außerhalb des gemessenen Bereichs verzichtet werden, weil dabei die Gefahr einen nichtlinearen Zusammenhang zu übersehen, entsprechend größer wird. Abbildung 1 zeigt ein van’t-Hoff-Diagramm für einen sehr interessanten Anwendungsfall. Es handelt sich um die Trennung der vier Konservierungsstoffe Dimethylphthalat, Methylbenzoat, Methylparaben und Ethylparaben an einer Umkehrphase mit eingebetteter polarer Gruppe, betrieben in einem Wasser-Methanol-Eluenten mit Phosphat auf pH 7 eingestellt. Die Messungen wurden in 5 °C-Schritten von 20 °C bis 75 °C aufgenommen und es zeigt sich über den gesamten Bereich eine gute Linearität, sodass auch mit deutlich weniger Messpunkten der Zusammenhang gut beschrieben werden könnte. Besonders auffällig sind die sehr unterschiedlichen Geradensteigungen, die letztlich auch zu Schnittpunkten der Geraden führen, also zu Elutionsumkehrungen im betrachteten Temperaturbereich. Dies hat für die Praxis ganz entscheidende Konsequenzen und es kann für den Erfolg der chromatographischen Trennung fatal sein, diese nicht entsprechend zu beachten.

Welche Temperatur ist die beste und warum?

Es ist eine durchaus übliche Praxis, HPLC-Trennungen bei einer Temperatur von 40 °C durchzuführen. Diese Temperatur lässt sich mit allen gängigen Säulenthermostaten unabhängig vom genauen Prinzip der Eluentenvorheizung und der Temperaturkontrolle im Säulenraum zuverlässig einstellen. Gleichzeitig sorgt sie bereits für einen guten Massentransport und somit bei entsprechenden Flussraten auch für recht schnelle Trennungen, ohne dabei die Langzeitstabilität der stationären Phasen maßgeblich zu beeinträchtigen. Wendet man die Temperatur von 40 °C allerdings auf das vorliegende Beispiel an, so erhält man von den vier injizierten Substanzen lediglich einen Peak mit einer Schulter sowie einen weiteren, auf den ersten Blick eigentlich unauffälligen Peak. Dies stellt sicherlich keine arbeitsfähige Methode für das vorliegende Anaylsenproblem dar und die Ursache liegt einzig in der Temperaturabhängigkeit der Selektivitäten. Das van’t-Hoff-Diagramm zeigt, dass bei 40 °C (senkrechte Linie) Methylbenzoat und Ethylparaben exakt koeluieren, während die Selektivität zwischen Dimethylphthalat und Methylparaben ebenfalls zumindest unzulänglich ist.

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LP-Tipp: zu Selektivität und Temperatur

Aufgrund ihrer chemischen Struktur zeigt eine Temperaturänderung in der Flüssigkeitschromatographie bei Substanzen unterschiedliche Auswirkungen auf die Selektivität. Dies liegt vor allem an den Wechselwirkungen der Verbindungen mit der stationären Phase. So können, wie im vorliegenden Beispiel, phenolische OH-Gruppen Wechselwirkungen mit der stationären Phase eingehen, die bei fehlenden Alkohol-Gruppen nicht stattfinden. Dies resultiert dann in unterschiedlichen Retentionszeiten der Substanzen.

Wie sind diese deutlich unterschiedlichen Steigungen zu erklären? Es ist auffällig, dass das Phthalat und das Benzoat ähnliche Steigungen im van’t-Hoff-Plot aufweisen. Gleiches gilt für die beiden Parabene, deren Retention aber in Vergleich deutlich stärker von der Temperatur abhängig ist. Die Ursache ist in der jeweiligen chemischen Struktur der Substanzen zu suchen. Die spezielle Funktionalisierung der verwendeten stationären Phase enthält eine Carbonamid-Funktion in der Alkylkette. Diese fungiert u.a. mit dem nichtbindenden Elektronenpaar am Stickstoff als Wasserstoffbrückenakzeptor und hier kann die recht starke Wasserstoffbrücken-Donorfunktion der phenolischen OH-Gruppen der beiden Parabene eine relativ starke Wechselwirkung eingehen, welche bei den beiden anderen Komponenten des Gemischs nicht möglich ist. Dem Retentionsmechanismus der Parabene in diesem Trennsystem liegt offensichtlich eine deutliche größere Übergangsenthalpie zugrunde und diese sorgt für die relativ starke Temperaturabhängigkeit ihrer Retentionsfaktoren.

Was diese spezielle Temperaturabhängigkeit für die praktische Anwendung der Methode bedeutet, zeigen die in Abbildung 2 dargestellten Chromatogramme sehr deutlich. Bei 20 °C weist die Methode ausgewogene Selektivitäten mit der Elutionsreihenfolge Dimethylphthalat < Methylparaben < Methylbenzoat < Ethylparaben auf. Wird die Temperatur schrittweise erhöht, so verschwindet zunächst bei ca. 35 °C der Peak von Methylbenzoat unter jenem von Ethylparaben. Bei 45 °C schiebt sich auch der Peak von Methylparaben über jenen von Dimethylphthalat und es sind de facto bei der gegebenen Bodenzahl nur zwei Peaks zu erkennen, obwohl vier Substanzen injiziert worden sind. Bei weiterer Temperaturerhöhung erscheint nun zunächst der Peak vom Methylbenzoat hinter jenem von Ethylparaben und oberhalb von 60 °C wird zusätzlich auch Dimethylpthalat hinter Methylparaben eluiert. Bei 75 °C ergibt sich schließlich wieder eine in etwa äquidistante Elution der vier Substanzen, allerdings in einer deutlich veränderten Reihenfolge. Die Farben der Chromatogramme repräsentieren die Qualität der Trennungen. In grün gekennzeichnet sind für eine quantitative Auswertung akzeptable Methoden. Schwarz zeigt Methoden, die zumindest alle vier Substanzen erkennen lassen, während bei den recht zahlreichen roten Chromatogrammen maximal drei Substanzen zu erkennen sind, bei 45 °C sogar nur zwei. Neben der veränderten Elutionsreihenfolge ist auch die absolute Retention aller Substanzen bei 75 °C deutlich verkürzt. Während die vier Substanzen bei 20 °C im Bereich von k = 2,6 bis k = 6,6 eluieren, reduziert sich dieser Bereich bei 75 °C auf k = 1,0 bis k = 2,6. Durch die geringeren Selektivitäten und niedrigen Retentionsfaktoren ist die Auflösung bei der hohen Temperatur deutlich reduziert und für eine quantitative Auswertung nicht mehr voll ausreichend. Die Analysenzeit ist andererseits ebenfalls um mehr als Faktor zwei von ca. 1,3 min auf ca. 0,6 min verkürzt. Grundsätzlich sollte als Kriterium beachtet werden, dass die Retention des ersten Peaks größer als k = 1 sein sollte, die des letzten Peaks aber nicht größer als k = 10. Unter diesem Gesichtspunkt ist die Methode bei 20 °C mit ihrer insgesamt auch deutlich größeren Auflösung klar überlegen. Mit einer Trennzeit von weniger als 1,5 min läuft die Analyse auch ausreichend schnell ab.

Selektivitätsoptimierung über die Temperatur

Mithilfe eines van’t-Hoff-Diagramms kann mit wenigen Messungen eine Vorhersage der k-Werte aller Substanzen für verschiedene Temperaturen erfolgen. Im einfachsten Fall gelingt dies aus Messungen bei zwei Temperaturen an den Grenzen des zugänglichen Bereichs, empfohlen wird jedoch eine dritte Temperatur zur Verifizierung der Linearität. Das resultierende Diagramm zeigt sofort Veränderungen von Selektivitäten und etwaige Elutionsumkehrungen an. Daraus kann graphisch die Temperatur bestimmt werden, bei der die vertikalen Abstände aller Punkte maximal sind, also die gesamte Verteilung der Selektivitäten optimal ist.

Im vorliegenden Beispiel in Abbildung 1 ist dies bei den Temperaturen 20 °C und bei 75 °C der Fall. n

* Dr. F. Steiner, Dr. K. Lovejoy: Thermo Fisher Scientific, 82210 Germering

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