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Alternative Diabetes-Therapien Hypoglykämika – Heilpflanzenextrakt auf bioaktive Inhaltsstoffe untersucht

Autor / Redakteur: Yu Wang et. al*,** / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Aktuelle Statistiken der International Diabetes Federation gehen im Jahr 2015 von rund 415 Millionen Diabetes-Erkrankten aus – Tendenz drastisch steigend! Aus diesem Grund sind alternative Diabetes-Therapien gefragt. Lesen Sie, wie ein Heilpflanzen-Extrakt auf Hypoglykämika untersucht wird.

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Abb.1: Der Genevac-Rocket-Verdampfer, mit dem Lösungsmittel entfernt wurden.
Abb.1: Der Genevac-Rocket-Verdampfer, mit dem Lösungsmittel entfernt wurden.
(Bild: Genevac)

Zu den akuten und chronischen Komplikationen von Diabetes gehören die diabetische Ketoacidose, Retinopathie, Nephropathie und der Schlaganfall, wobei Hyperglykämie als wichtiger pathogener Faktor für die Entwicklung solcher Komplikationen gilt. Daher steht die Senkung von postprandialen Blutzuckerspitzen im Mittelpunkt von Diabetesforschung und Präventionsprogrammen. Der Transport von Glukose durch biologische Membranen erfolgt mithilfe von Glukosetransportern (GLUT) und Natrium/Glukose-Cotransportern (SGLT).

Beide Glukosetransporter-Typen sind Ansatzpunkte von aktuellen Diabetestherapien. Beispielsweise wurden SGLT2-Inhibitoren entwickelt, welche die Glukoseausscheidung in den Harn erhöhen und für diesen Zweck klinisch angewendet werden. Bisher gibt es nur wenige Veröffentlichungen über natürliche SGLT1-Inhibitoren.

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Seit vielen Jahrhunderten werden in Asien mehrere Heilpflanzen zur Blutzuckersenkung eingesetzt, wobei sowohl die phytogenen Wirkstoffe als auch deren Wirkmechanismen unbekannt sind. Das Ziel der vorliegenden Studie war die Bewertung der hemmenden Wirkung von Gymnema sylvestre auf SGLT1. Gymnema sylvestre ist eine von mehreren Heilpflanzen, die im Rahmen der traditionellen chinesischen Medizin als Hypoglykämika verwendet werden.

Herstellung des Heilpflanzenextrakts

Trockene Blätter von Gymnema sylvestre (300 g) werden zu einem feinen Pulver zerrieben und nacheinander mit Pentan (2 x 2 l), Methanol/Wasser (7/3,V/V; 2 x 2 l) und Methanol (2 x 2 l) extrahiert. Die beiden polaren Extrakte, d.h. der zweite und der dritte Extrakt, wurden miteinander kombiniert und die Lösungsmittel mit einem Genevac-Rocket-Verdampfer (s. Abb. 1) entfernt. Nach Lyophilisierung der Rückstände lag die polare Fraktion II vor. Wegen der guten Handhabungseigenschaften des Lyophilisats (lockerer, leicht abwiegbarer Feststoff) war die Lyophilisierung die Probenvorbereitung der Wahl. Für die Lyophilisierung müssen zunächst die organischen Lösungsmittel entfernt werden. Leider schäumen Methanol/Wasser-Extrakte von Gymnema sylvestre sehr stark, was eine Entfernung der Lösungsmittel mittels Rotationsverdampfern ausschloss.

Der Verdampfer Genevac Rocket erlaubte dagegen nicht nur die unbeaufsichtigte Entfernung der organischen Phase bzw. beider Lösungsmittel sondern auch die Vermeidung aller schaumbedingten Probleme. Das Kolbensystem Rocket Sample Genie (Einklinker Abb.1) ermöglicht eine Trocknung direkt in einem geeigneten Gefäß der Wahl. Ein Glasfläschchen kann mit einem Spezialadapter und einem Stützkragen direkt mit einem 250-ml-Kolben verbunden werden. Das Lösungsmittel im Kolben wird verdampft, das Produkt im Glasfläschchen getrocknet und das Glasfläschchen anschließend abgenommen.

Auf diese Weise entfallen zeitaufwändige Probentransferschritte, die auch die Wiederfindung verringern können. Mithilfe des Rocket-Verdampfers und der Sample-Genie-Kolben konnten 1350 ml des Methanol bzw. des Wasser/Methanolextrakts, d.h. 6 x 250-ml-Kolben, in einem einzigen Tag getrocknet werden. Darüber hinaus wurde das getrocknete Produkt in abnehmbaren Glasfläschchen gesammelt. Mithilfe des vor der Verdampfung bestimmten Leergewichts konnte die Extraktionsausbeute zudem unmittelbar bestimmt werden.

Blutzuckerspiegel senken – Hemmende Wirkung von Gymnemasäuren auf SGLT1

Zur Bestimmung der phytogenen Wirkstoffe wurden Eier von Xenopus laevis mit cRNA für hSGLT1 mikroinjiziert. Dann wurden mitttels der Voltage-Clamp-Methode unter Einsatz von zwei Elektroden die glucosebedingten Transportströme durch die Membran aufgezeichnet und eine Funktionsanalyse durchgeführt. Zur Isolierung der SGLT1-Inhibitoren in der polaren Fraktion II von Gymnema sylvestre wurde eine RP-MPLC mit Wasser (Fraktion II-1) durchgeführt und die Säule dann mit Methanol gespült (Fraktion II-2). Nach Verdampfung der organischen Lösungsmittel und Lyophilisierung wurden Fraktionen II-1 und II-2 im SGLT1-Bioassay getestet.

Fraktion II-2 hatte SGLT1-hemmende Eigenschaften. Daher wurde diese Fraktion in einer Normalphasen-Säulenchromatographie weiter aufgereinigt. Die so erhaltenen acht Fraktionen (II-2/A bis II-2/H) wurden erneut auf SGLT1-hemmende Aktivität getestet (s. Abb. 2).

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Die Subfraktion II-2/B zeigte die stärkste SGLT1-Hemmung mit einer Rate von 80 Prozent und wurde daher mittels präparativer RP-HPLC weiter fraktioniert. Es wurden 26 HPLC-Fraktionen gesammelt. Die organischen Lösungsmittel wurden mit einem Genevac Rocket entfernt, die Proben gefriergetrocknet und in den natürlichen Konzentrationsverhältnissen auf SGLT1-hemmende Aktivität getestet (s. Abb. 3).

Die höchsten SGLT1-Inhibitionsraten wurden in den HPLC-Fraktionen 22 und 24 ermittelt (45% bzw. 48%). Die Struktur der Wirkstoffe wurde mit LC-MS/MS, UPLC-TOF-MS und 1D/1D-NMR ermittelt. Es handelte sich um Gymnemasäuren V (1) und XV (2), deren Strukturformeln in Abbildung 4 dargestellt sind.

Schlussfolgerung

Es ist bekannt, dass Gymnemasäuren bei Ratten die Blutzuckerspiegel nach oraler Glukosebelastung senken. Der zugrunde liegende Wirkmechanismus wurde bisher noch nicht näher untersucht. In dieser Studie konnte mithilfe von hSGLT1-Bioassays gezeigt werden, dass Gymnemasäuren den SGLT1 mit hoher Affinität hemmen. Die Gymnemasäuren V und XV sind dabei die Wirkstoffe mit höchster SGLT1-Hemmung in Gymnema sylvestre. SGLT1 kommt in Bürstensaummembranen der intestinalen Epithelzellen in hohen Konzentrationen vor. Die vorgestellte Studie weist daher auf einen möglichen Einsatz dieser Triterpensaponine als Inhibitoren der elektrogenen Glukoseaufnahme im gastrointestinalen Trakt hin.

Literatur:

1] Yu Wang, Corinna Dawid, Gabor Kottra, Hannelore Daniel, Thomas Hofmann Gymnemic Acids Inhibit Sodium-Dependent Glukose Transporter 1 J. Agric. Food Chem. 2014, 62, 5925-5931.

* Y. Wang, C. Dawid, G. Kottra, S. Pickrahn, H. Daniel, T. Hofmann: Technische Universität München Lehrstuhl für Lebensmittelchemie und molekulare Sensorik, 85354 Freising

* *A.Wake: Genevac Ltd, Ipswich/ Großbritannien

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