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Mykotoxine

Isotopenverdünnungsanalytik von Mykotoxinen mit GC/MSD

31.07.2007 | Autor / Redakteur: Wolfgang Brodacz* / Marc Platthaus

Abb. 1 Vor allem Getreide und andere kohlenhydratreiche Lebensmittel neigen zur Schimmelbildung und sind häufig mit Mykotoxin belastet.
Abb. 1 Vor allem Getreide und andere kohlenhydratreiche Lebensmittel neigen zur Schimmelbildung und sind häufig mit Mykotoxin belastet.

Natürliche Gifte nehmen im Bewusstsein der Verbraucher im Vergleich zu künstlichen wie Pestizide oder Insektizide häufig nur eine untergeordnete Rolle ein. Jedoch stellen gerade Schimmelpilzgifte eine große Bedrohung für den Menschen dar. Die genaue Analyse der Mykotoxine ist also von enormer Wichtigkeit. Hierzu kann nun auch die Isotopenverdünnunganalytik in Verbindung mit GC/MSD eingesetzt werden.

Mykotoxine sind Stoffwechselprodukte von Schimmelpilzen; bis heute sind etwa 100 000 Schimmelpilze identifiziert worden, von denen über 400 teilweise sehr toxische Substanzen für Menschen und Tiere produzieren können. Schimmelpilzarten können in pflanzlichen Lebensmitteln – besonders bei kohlenhydratreichen Nahrungsmitteln wie Getreide, Samen oder Nüsse – als direkte Verunreinigung schon vor der Ernte vorkommen oder während der Lagerung oder dem Transport gebildet werden.

Erhalten Tiere mit Schimmelpilzen belastete Futtermittel, können auch Lebensmittel tierischer Herkunft mit Mykotoxinen belastet sein. Durch Kochen, Backen oder andere küchentechnische Vorgänge werden die meisten Mykotoxine nicht zerstört. Daher ist eine Kontrolle auf einen möglichen Befall von Nahrungsmitteln sehr wichtig.

Neben bioanalytischen wie den Enzym-immunoassays sind auch chromatographische Methoden wie die HPLC oder die GC einsetzbar. Mit der Verfügbarkeit von vollständig 13C-markierten Mykotoxinen kann nun auch die Isotopenverdünnungs-Massenspektrometrie in der Mykotoxinanalytik ihre Vorzüge ausspielen. Gemeinsam mit den Stärken aktueller GC/MSD-Systeme steht eine Methodik zur Verfügung, die den ständig steigenden Anforderungen an eine gesicherte Analytik der hochgiftigen Mykotoxinen A-Trichothecene T-2-Toxin und HT-2-Toxin gewachsen ist.

Aufreinigung der Proben zur Analyse der Mykotoxine

Zur Extraktion der Proben werden, wie in der Mykotoxinanalytik weit verbreitet, 25 g Einwaage mit 100 ml des Gemisches Acetonitril/Wasser (84/16) intensiv geschüttelt bzw. gerührt. Ebenfalls obligatorisch ist die Vorreinigung der Trichothecene über eine SPE-Kartusche. Bei der vorliegenden Methode ist dies eine Mycosep 227 Trich+ von Romerlabs, die sich durch schnelle und einfache Handhabung auszeichnet (s. Abb. 3) [1]. Aufgrund von Vorkommen, Toxizität und (geplanten) Grenz- bzw. Richtwerten liegen die angestrebten Bestimmungsgrenzen von A-Trichothecenen um ein bis zwei Zehnerpotenzen unter den Belastungen durch B-Trichothecene (Leitsubstanz: Deoxynivalenol, DON). Während für Letztere die Mycosep-227-Reinigung völlig ausreicht [2], muss wegen der für den hochempfindlichen Nachweis der A-Trichothecene notwendigen wesentlich höheren Matrixanreicherung eine zusätzliche Aufreinigung über Multisep 216 (ebenfalls von Romer-labs) erfolgen.

Im Gegensatz zu anderen Mykotoxinen spricht keiner der üblichen Detektoren in der GC (ECD) oder HPLC (FLD oder UV) besonders empfindlich auf A-Trichothecene an. Die Massenspektrometrie ist folglich für beide Chromatographievarianten die Detektionsmethode der Wahl.

Mit der hohen Trennleistung der Gaschromatographie kombiniert, stellt die Massenspektrometrie im Scan-Modus mit Vollspektren sehr gute Identifizierungssicherheit und im Selected-Ion-Monitoring (SIM) auch eine hohe Empfindlichkeit zur Verfügung. Beim aktuellen Agilent GC/MSD-5975 sind beide MS-Verfahren auch simultan einsetzbar, sodass Spuren mit drei diagnostischen Ionen identifiziert werden und bei höheren Konzentrationen Spektrenvergleiche möglich sind. Die A-Trichothecene müssen dazu allerdings vorher zu flüchtigen Derivaten umgesetzt werden. Sehr gut geeignet ist dafür die Silylierung mit N-methyl-N-trimethylsilyl-trifluoro-acetamid (MSTFA) mit Zusatz von einem Prozent Trimethylchlorosilan. In der Dopinganalytik schon länger im Einsatz, ist es mit einem Siedepunkt von 131 °C das flüchtigste Silylierungsreagenz und kann deshalb gleichzeitig als Lösungsmittel eingesetzt werden. Seine Reaktivität ist ausreichend für die vollständige Silylierung der A-Trichothecene und auf den robusten GC-Phasen HP-5ms oder DB-35ms kommt es noch zu keiner Schädigung. Im Gegensatz zu vielen anderen Silylierungsmitteln ist folglich eine aufwändige Zerstörung des MSTFA-Überschusses mit Wasser und die umständliche Re-Extraktion nicht mehr notwendig. Das ermöglicht einfaches und sehr schnelles Silylieren (Schritte: Eindampfen zur Trockene; MSTFA-Zugabe; 30 Minuten Reaktionszeit bei Raumtemperatur; Injektion im GC/MSD) [3]. MSTFA ist außerdem für die Zielanalyten ein gutes Lösungsmittel, der Siedepunkt ermöglicht Solvent-Effekte bei hohem Temperaturprogramm-Niveau und damit kurze GC-Zykluszeiten.

Kleine Reagenzvolumen (50 bis 100 µl) steigern die Nachweisempfindlichkeit und reduzieren die Kosten des Silylierungsmittels und der isotopenmarkierten Standards (z.B. ist Silylierung direkt im High-Recovery-Vial möglich). Der permanent präsente und hohe Reagenzüberschuss verhindert den Zerfall der TMS-Derivate bei der Lagerung und Injektion.

Voll 13C-markierte interne Standards

Der Eckpfeiler der Quantifizierung und ausschlaggebend für die vereinfachte Handhabung der gesamten Methode ist der Einsatz von isotopenmarkierten internen Standards. Die vielfältigen Vorteile kommen besonderes dann zum Tragen, wenn die Dotierung der gelabelten Toxine sofort nach der Extraktion erfolgt. Das praktisch identische Verhalten von Ziel-analyten und 13C-markierten Analogen ist der entscheidende Vorteil der Isotopenverdünnungs-Massenspektrometrie (IVMS). Damit sind alle nachfolgenden Arbeitsschritte quantitativ unter Kontrolle dieser optimalen internen Standards. Alle Verluste bei Transferschritten oder beim Clean-up, Präzisionsverluste beim Manipulieren mit sehr kleinen Volumen, Unregelmäßigkeiten beim Einengen oder Aliquotieren werden automatisch ausgeglichen. Wenn dann noch vollständig 13C-markierte interne Standards verwendet werden, können selbst schwer kontrollierbare prä- und postchromatographische Matrixeffekte kompensiert werden. Denn im Gegensatz zu deuterierten Standards zeigen sie aufgrund des geringeren, so genannten Isotopeneffekts selbst bei der Kapillar-GC absolut identische Retentionszeiten wie die nativen Toxine [4]. Auch für die besonders wichtigen, da hochtoxischen A-Trichothecene T-2-Toxin und HT-2-Toxin stehen nun voll 13C-markierte Analogen in hoch isotopenangereicherter Form als gebrauchsfertige Lösungen zur Verfügung (Fa. Biopure).

Für die B-Trichothecen-Analytik gibt es bereits 13C15-DON und 13C17-3-Acetyl-DON. Das Analoge der Leitsubstanz DON wurde schon mehrfach sehr erfolgreich bei Ringversuchen mit dem GC/MSD eingesetzt [4]. Eine wesentliche Verbesserung der Quantifizierung mittels LC/MS/MS darf auch bei Verwendung der ebenfalls bei Biopure erhältlichen gelabelten Standards 13C34-Fumonisin B1 und 13C20-Ochratoxin A erwartet werden.

Eigene Versuche und die Erfahrungen eines EU-weiten Ringversuches zeigen, dass sich 13C24-T-2-Toxin als interner Standard für T-2-Toxin sehr gut eignet, aber nicht gleichzeitig auch HT-2-Toxin ebenso gut kontrollieren kann. Die strukturellen Unterschiede zwischen beiden Toxinen (OH-Gruppe anstatt CH3COO) sind groß genug, um eine gute Korrektur durch den jeweils anderen markierten Standard zu verhindern (s. Abb. 3). Im vorliegenden Beispiel verwendet man daher zugunsten einer optimalen Auswertung der beiden wichtigsten A-Trichothecene auch beide gelabelten internen Standards. Wie die Molekülstrukturen (s. Abb. 3) nahe legen, sehen die Verhältnisse zwischen 13C24-T-2-Toxin und Diacetoxyscirpenol (DAS) bzw. zwischen 13C22-HT-2-Toxin und Monoacetoxyscirpenol (MAS) wesentlich günstiger aus. Eigene Versuche betätigen, dass DAS bzw. MAS in der Routineanalytik über die für diese Analytik ohnehin notwenigen internen Standards 13C24-T-2-Toxin bzw. 13C22-HT-2-Toxin ausreichend genau ausgewertet werden können.

Analyse mit GC/MSD

Die Voraussetzung für hohe Empfindlichkeit in der GC/MS beginnt schon beim Einlasssystem. Die EPC des Agilent GC 6890 unterstützt eine Splitless-Injektion mittels Druckpuls, wodurch ein rascher Probentransfer in die Kapillare entsteht und problemlos große Aufgabenvolumen (5 µl ohne Peakverbreiterung) realisiert werden können [5]. Anschließend sorgt das inerte Injektordesign und die Inertheit der DB-35ms-Säule dafür, dass die teilweise empfindlichen Analyten unbeschädigt im MSD ankommen. Die Fragmentierung sollte erst durch Elektronenbeschuss in der Ionenquelle stattfinden. Dies ist nicht immer selbstverständlich, in der Praxis wird die Empfindlichkeit von Massenspektrometern nicht selten durch aktive Oberflächen im GC begrenzt. Der IVMS mit 13C-gelabelten internen Standards werden oft sehr hohe Kosten nachgesagt. Bei entsprechendem Methoden-Design können die Mengen an teuren Standards jedoch gering gehalten werden, und die Zusatzkosten sind angesichts der enormen Qualitätsverbesserung vertretbar. Wichtig hierfür ist, dass alle Aliquotierungen vor die Dotierung gesetzt werden und das Messlösungsvolumen möglichst gering gehalten wird (50 bis 100 µl genügen und durch den internen Standard ist das quantitative Handling unkritisch). Durch die hohe Empfindlichkeit des Agilent MSD-5975 kann in der Routineanalytik die notwendige Menge an internem Standard soweit gedrückt werden (Bedingung: keine zusätzliche Aliquotierung; 50 bis 100 µl MSTFA; 5 µl Injektionsvolumen; hochempfindlicher SIM-Auswertung), dass man für die internen Standards mit weniger als etwa 50 Eurocent pro Probe auskommt. Das neu entwickelte Trace-Ion-Detection und ein spezielles Tuning des MSD-Modells 5975C unterstützen den Empfindlichkeitsgewinn. Während die in einer EU-Methodenempfehlung [3] vorgeschlagene Methylpolysiloxan-Phase mit fünf Prozent Phenylanteil (z.B. HP-5) hinsichtlich der wichtigsten Analyten T-2-Toxin und HT-2-Toxin keine Basislinientrennung erreicht, ist die mittelpolare Phase DB-35ms von Agilent bestens geeignet, die vier A-Trichothecene DAS, MAS, T-2-Toxin und HT-2-Toxin mit einem schnellen Temperaturprogramm sehr gut zu separieren (s. Abb. 2). Auch die Auswahl der SIM-Ionen wurde verbessert, sodass selbst bei hohen Matrixbelastungen stabilere Ionenverhältnisse und damit zuverlässigere Identifizierungen und Quantifizierungen erzielt werden.

Hafer gilt als besonders störende Matrix, ist als die Haupteintragsquelle für A-Trichothecene aber umso wichtiger in der Kontrollanalytik. Abbildung 2 zeigt oben die Totalionenströme (TIC) des Kalibrierstandards und einer dotierten Haferprobe mit einer Anreicherung von 5 g Matrix/ml Messlösung (M = 0,2). Mit gleicher Zeitachse sind da-runter die Targetionen der vier Zielanalyten und der beiden überlagerten 13C-markierten internen Standards dargestellt (für eine bessere Übersichtlichkeit wurden die zwei Qualifier-Spuren ausgeblendet). Die gezeigten Kontaminationen von 35 ppb MAS, 56 ppb HT-2-Toxin, 27 ppb DAS und 22 ppb T-2-Toxin sind aufgrund der guten Reinigungswirkung der kombinierten Mycosep- und Multisep-Säulen und der hohen Selektivität des GC/MSD im SIM selbst unter schwierigen Bedingungen (bei Hafer oder Futtermittel) gut quantifizierbar. Die EI-Massenspektren der silylierten nativen und voll 13C-markierten Toxine HT-2 bzw. T-2 sind in Abbildung 4 bzw. 5 gegenübergestellt. Tabelle 1 zeigt für alle vier Zielanalyten die resultierenden Quantifizierungs-Ionen (Target T) mit zwei korrespondierenden Qualifier-Ionen (Q1 und Q2). Für die internen Standards wird zur Absicherung der Peak-Reinheit ein Qualifier (Q1) mitgemessen. Obwohl nach theoretischen Überlegungen für die Quantifizierung von 13C24-T-2-Toxin das Ion 455 verwendet werden sollte, hat die Praxis bei den wichtigsten Matrizes (Hafer, Futtermittel und Müsli) gezeigt, dass sehr häufig Störungen bei der Analyse auftreten können. Das Ion 365 ist im Gegensatz dazu praktisch keinen Matrix-Interferenzen ausgesetzt und zudem dominanter. Das aus theoretischen Gründen propagierte Ion 185 sollte keinesfalls verwendet werden, da es im internen Standard zu prominent vertreten ist.

Fazit

Spezielle Reinigungssäulen aus der Mycosep- und Multisep-Familie bereiten den Rohextrakt auf, MSTFA beschleunigt die Silylierung zu stabilen TMS-Derivaten, die auf mittelpolaren Kapillaren wie der DB-35ms in kurzer Zeit bestens aufgetrennt werden. Die Kombination der aktuellen sensitivitätsgesteigerten GC/MSD-Generation mit voll 13C-markierten internen Standards resultiert in einer sehr nachweisstarken und quantitativ zuverlässigen Methodik für den sicheren Nachweis hochtoxischer Mykotoxine.

Literatur

[1] Krska R., Baumgartner S., Josephs R.; „The state-of-the-art in the analysis of type-A and -B trichothecene mycotoxins in cereals“; Fresenius J. Anal Chem; 371; 285-299; 2001

[2] W. Brodacz, „Langzeiterfahrungen in der GC-Routineanalytik von Mykotoxinen“ LaborPraxis LP 7/8, S. 32-34; August 2005

[3] Breidbach, A., Povilaityte, V., Mischke, C., Doncheva, I., Stroka, J; „T-2 and HT-2 by GC/MS for official food control - a validated method”; Poster anl. 29. Mykotoxin-Workshop 14.-16.05. 2007 Fellbach, Germany

[4] W. Brodacz, „Isotopenmarkierte interne Standards in der Mykotoxin-Analytik“ Labo Februar, S. 50-53; Februar 2007

[5] W. Brodacz, „Tuning von GC-Methoden“ LaborPraxis LP 3, S. 40-42; März 2006

W. Brodacz, AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit GmbH, 4020 Linz/Österreich

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