Mykotoxine Keine Chance für Mykotoxine

Mykotoxine in Lebens- und Futtermitteln zu bestimmen, ist heute gang und gäbe, nicht aber, so scheint es, die gesamte Analysenprozedur zu automatisieren. Wie umfangreich und effizient dies möglich ist, zeigt der nachfolgende Beitrag.

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Mykotoxine sind von Schimmelpilzen (z.B. Aspergillus [Aflatoxine], Penicillum [Ochratoxin A] oder Fusarium [Trichothecene, Fumonisine, Deoxynivalenol und Zearalenon]) gebildete Stoffwechselprodukte, die aufgrund ihrer Giftigkeit (Toxizität) in Lebens- und Futtermitteln unerwünscht sind. Sie sind für Menschen selten akut gesundheitsschädigend, sie können jedoch Krebs hervorrufen und das Erbgut schädigen. Mykotoxine unterliegen daher strengen Höchstwertregelungen [1].

Den Ausführungen des Niedersächsischen Landesamtes für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit ist prinzipiell nichts hinzuzufügen. Vielleicht wäre es sinnvoll zu erwähnen, dass sich ein Aufkeimen von Schimmelpilzen nicht wirklich verhindern lässt und dass stets damit zu rechnen ist, in landwirtschaftlichen Erzeugnissen, die gelagert oder verarbeitet werden, auf Mykotoxine zu stoßen. Diesen Gedanken konsequent weiter geführt: Mykotoxine können auch in Milch, Eier und Fleisch gelangen, wenn kontaminiertes Futter, etwa Getreideerzeugnisse, an Nutztiere verfüttert wird.

Da sich, auf den Punkt gebracht, eine Belastung mit Mykotoxinen und die da-raus resultierenden Konsequenzen gemäß der vorangehenden Ausführung nie ganz verhindern lassen, sind geeignete Maßnahmen zu ergreifen, die ein mögliches Gesundheitsrisiko für den Verbraucher minimieren helfen. Die instrumentelle Analytik erweist sich im Kontext eines aktiven Verbraucherschutzes als tragende Säule.

„Ein wichtiges Instrument zur Identifizierung und Quantifizierung von Mykotoxinen in Lebens- und Futtermitteln ist die HPLC in Kombination mit der mehrdimensionalen massenselektiven Detektion (MS/MS)“, wie der Applikationsexperte Dr. Oscar G. Cabrices von der Gerstel Inc. in Baltimore, Maryland/USA sagt.

Gemeinsam mit Kollegen entwickelte Dr. Cabrices eine HPLC-MS/MS-Methode einschließlich der vollständig automatisierten Probenvorbereitung zum Nachweis von 14 Mykotoxinen aus agrarbasierten Matrices. Im Zuge der Methodenentwicklung wurden Mais und Weizenproben mit den nachfolgend beschriebenen Zielanalyten dotiert und untersucht: Aflatoxin B1, B2, G1 und G2; Ochratoxin-A, Fumonisin B1, Neosolaniol, Diacetoxyscirpenol, HT-2 Toxin, T-2 Toxin, Zearalenon, Deoxynivalenol, 3-Acetyldeoxynivalenol und Fusarenon-X [2].

Besonderes Augenmerk legten Dr. Cabrices und Kollegen auf eine möglichst effiziente Probenvorbereitung. „Wer auf einen optimalen Einsatz von Personal und Technik Wert legt, kommt an der Automatisierung manuell aufwändiger Arbeitsschritte nicht vorbei“, bringt es der Applikationsexperte auf den Punkt. Dieses Ziel vor Augen entwickelten und realisierten Dr. Cabrices und Kollegen ihre Multimykotoxinmethode unter Einsatz eines Gerstel-Multi-Purpose-Samplers (MPS XL), der dazu taugt, die zahlreichen erforderlichen Probenvorbereitungsschritte adäquat zu automatisieren.

Der MPS verfügt über zwei Türme, etwa zum reibungslosen Handling unterschiedlich großer Lösemittelvolumen, und wurde mit unterschiedlichen Werkzeugen ausgestattet, u.a. mit einer Doppelpositionszentrifuge (CF-100), einer dispersiven Festphasenextraktion, namentlich der Disposable Pipette Extraction (DPX), sowie der Option, Lösungen und Eluat vortexen und einengen zu können.

Die Probenvorbereitung im Fokus

Die Trennung der Analyten erfolgte mit einem HPLC-System Agilent 1200 Serie auf folgender Säule: Phenomenex-Gemini-Säule 5 µm, 110 Å, 150 x 4,6 mm, unter Verwendung eines Lösemittelgradienten; bei der mobilen Phase handelte es sich um ein Gemisch aus Methanol, Wasser und Essigsäure (89:10:1 bis 97:2:1) mit 5 mM Ammoniumacetat. Die mehrdimensionale massenselektive Detektion geschah auf einen Qtrap 4500-MS-System von AB Sciex.

Die einzige manuell auszuführende Tätigkeit im Rahmen ihrer Methode sei, wie Dr. Cabrices nach erfolgreichem Abschluss der Methodenentwicklung berichtet, das Einwiegen von einem Gramm der homogenisierten, im vorliegenden Fall Getreideprobe in ein 10-mL-Vial, das verschlossen und auf dem Probenteller des MPS platziert wird. Alle weiteren Schritte übernimmt der MPS softwaregesteuert. Dazu gehöre die Zugabe von 4 mL einer Acetonitril-Wasser-Mischung (84:16) in das Vial; Transport des Vials zum Agitator; Durchmischen (1 h, 55 °C, 500 umin^–1), Zentrifugieren. Vom Überstand werden dann 500 µL für die nachfolgende DPX entnommen.

Automatisierungsgrad maximieren

„Die DPX spielt für die Aufreinigung des Probenextraktes und damit für die gesamte Probenvorbereitung eine zentrale Rolle“, wie Dr. Cabrices erklärt. Die DPX wurde von Dr. William E. Brewer an der University of South Carolina entwickelt, 2001 zum Patent angemeldet und von Gerstel auf dem MPS-Autosampler automatisiert: „Während bei der klassischen Festphasenextraktion die Festphase in Form einer gepackten Säule vorliegt“, beschreibt Dr. Cabrices, „ist die Festphase im Fall der DPX innerhalb einer Pipettenspitze frei beweglich.“ Der Stoffaustausch zwischen der festen Phase, im vorliegenden Fall handelte es sich um DPX-Myco bzw. DPX-Wax, mit der flüssigen Probe werde um ein Vielfaches beschleunigt, zudem sei das benötigte Probenvolumen deutlich geringer. Die Extraktionsleistung hänge auch eher von der Zeit ab, in der Lösungen und Sorbens ins Gleichgewicht kommen, als von Durchflussraten durch ein gepacktes Bett.“ Und während klassische SPE-Kartuschen verstopfen können, betont Dr. Cabrices weitere Vorzüge der DPX, ließen sich mittels DPX selbst feststoffhaltige oder viskose Proben störungsfrei abarbeiten.

Sobald die DPX abgeschlossen ist, überführt der MPS 200 µL des aufgereingten Extraktes in ein vorbereitetes 2-mL-Vial; das Eluat wird in der mVAP-Station des MPS eingedampft und der Rückstand in 500 µL des LC-Laufmittels wieder aufgenommen. Das resultierende Eluat dient der unmittelbar nachfolgenden HPLC-MS/MS-Bestimmung von Mykotoxinen.

Methodenentwicklung effizient machen

Bei der Entwicklung ihrer Multimethode zum Nachweis einer großen Zahl gängiger und weitverbreiteter Mykotoxine habe man großen Wert auf maximale Effizienz gelegt, berichtet Dr. Oscar Cabrices, und dieses Ziel habe man erreicht: „Wir konnten den gesamten Arbeitsablauf, von der Probenvorbereitung bis zur HPLC-MS/MS-Bestimmung, automatisieren und damit die Analyseneffizienz steigern. Als wesentlich für ihr Konzept habe sich die DPX erwiesen, die nur kleine Probenvolumina (500 µL) erfordere, was die Dauer der Extraktion auf 5 bis 9 min je Probe reduziere. Zudem ermögliche die Steuersoftware Maestro des MPS, die Probenvorbereitung mit der HPLC-MS/MS-Analyse zeitlich zu verschachteln (Prep-Ahead-Funktion), was in puncto Zeit weiteres Einsparungspotenzial generiere. Die durchschnittliche Extraktionsleistung habe bei >70 % gelegen, die Reproduzierbarkeit sei mit einem %RSD von <15 % gut gewesen. Die Kalibration ergab eine Linearität der Methode im Bereich von 2 bis 500 ng/L.

Mit dem verwendeten LC/MS-System konnte eine sehr gute Linearität mit R²-Werten von 0,98 und größer verzeichnet sowie durchschnittliche Genauigkeiten von wenigstens 88 % bestimmt werden. Zudem wurden Quantifizierungsgrenzen erreicht, die unterhalb der Werte lagen, die von der Europäischen Kommission (EK) und der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) festgelegt wurden. Alles in allem, stellt Dr. Oscar Cabrices fest, habe ihre Arbeit gezeigt, dass sich die Bestimmung von Mykotoxinen vergleichsweise simpel von der manuellen Vorgehensweise in ein vollständig automatisiertes Prozedere überführen lässt. „Handarbeit“, bemerkt der Applikationsexperte, „war gestern.“

Literatur

[1] Niedersächsischen Landesamtes für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (www.laves.niedersachsen.de/portal/live.php?navigation_id=20053&article_id=100666&_psmand=23)

[2] Oscar G. Cabrices, Fred F. Foster, Edward A. Pfannkoch, Andre Schreiber: Preparation and Analysis Workflow for Mycotoxin Residues in Different Food Matrices, AppNote 10/2013, (www.gerstel.de/pdf/p-lc-an-2013-10.pdf)

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