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Analyse biogener VOCs per GC/MS Kinderwunsch: Der Duft der Frauen und was er über ihre Fruchtbarkeit verrät

Autor / Redakteur: Guido Deußing* / Dr. Ilka Ottleben

Eine Frau mit Kinderwunsch kann sich verschiedener Methoden bedienen, um den Zeitpunkt innerhalb ihres Menstruationszyklus zu bestimmen, der sich als günstig erweist, um schwanger zu werden. Auch die Bestimmung flüchtiger Biomarker in Form von flüchtigen organischen Verbindungen (VOCs) per GC/MS ist in mehrerer Hinsicht zielführend.

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Abb. 1: Für Frauen mit Kinderwunsch gibt es allerlei diagnostische Methoden, mit denen sich möglichst genau ihre „fruchtbaren Tage“ bestimmen lassen sollen. Eine generelle Aussage über die Fruchtbarkeit der Frau zu treffen, ist mit diesen Methoden jedoch nicht möglich.
Abb. 1: Für Frauen mit Kinderwunsch gibt es allerlei diagnostische Methoden, mit denen sich möglichst genau ihre „fruchtbaren Tage“ bestimmen lassen sollen. Eine generelle Aussage über die Fruchtbarkeit der Frau zu treffen, ist mit diesen Methoden jedoch nicht möglich.
(Bild: ©lassedesignen - stock.adobe.com)

Wenn es um die Partnerwahl geht, folgt der Mensch weniger dem, was er sieht, vielmehr dem, was seine Nase registriert. Des Menschen Riechorgan ist vielseitig begabt; es nimmt sowohl offenkundig Olfaktorisches wahr, aber auch Pheromone, die das Gegenüber quasi geruchsfrei emittiert und die Organismen auf eine für uns unbewusste Weise kommunizieren lässt. Die dem Frauenkörper entströmenden flüchtigen organischen Verbindungen (VOCs), die in der Lage sind, des Mannes Begierde zu triggern, entstammen dem Stoffwechsel weiblicher Sexualhormone; deren wichtigste Vertreter sind die Östrogene und Progesteron. Diese Hormone steuern zusammen mit anderen den weiblichen Menstruationszyklus und sorgen auch für die Fruchtbarkeit der Frau.

Kinderwunsch: Die Weibliche Fruchtbarkeit im Blick

Es lässt sich damit, sozusagen evolutionsbiologisch, erklären, warum Frauen während ihrer fruchtbaren Tage von der männlichen Nase als besonders attraktiv wahrgenommen werden. Inzwischen hat man auch erkannt, warum manche Frau respektive ihr individueller Körpergeruch bei Männern besser ankommt als der Geruch einer anderen Frau: Auf den Mann besonders anziehend wirken Damen mit hohem Östrogenspiegel und niedrigen Progesteronwerten [1]. Ein Hormonspiegel mit viel Östrogenen und wenig Progesteron zeugt von Fruchtbarkeit. Sie bleibt allerdings nicht ein Leben lang auf einem konstant hohen Niveau erhalten, sondern nimmt mit dem Alter ab. Biologisch lässt sich das so erklären, dass das Verhältnis der Sexualhormone sich zu Ungunsten der Östrogene verschiebt.

Dieser Tatsache gegenüber steht der Wunsch nicht weniger Frauen, den Zeitpunkt einer Schwangerschaft frei zu wählen und die Mutterschaft den Lebensbedingungen individuell anzupassen. Das funktioniert, so lange Mutter Natur mitspielt. Bei mancher Frau aber erweist sich der Weg in die Schwangerschaft als steinig und schwer: Für geschätzt 1,6 Mio. Frauen in den USA im Alter bis 44 Jahren wird der Versuch, auf natürliche Weise schwanger zu werden, zur Herausforderung, meint Stephanie Marie Ong von der Arizona State University, USA [2].

Der Markt der Fruchtbarkeitsdiagnostik kann laut Ong in den USA mit 3,5 Mrd. US-Dollar beziffert werden. Allerdings lassen sich mithilfe dieser diagnostischen Methoden nach Auffassung der Wissenschaftlerin bislang keine Aussagen über die Wahrscheinlichkeit machen, ob eine Frau 1. grundsätzlich und 2. mit zunehmendem Lebensalter schwanger werden kann. Zwar gelinge es, die Zeit des Eisprungs (Ovulation) auf unterschiedliche Weise recht genau zu ermitteln – und damit auch der optimale Zeitpunkt für den Zeugungsakt –, z.B. vermittels Basaltemperaturmessung, Kalendermethode oder spezieller Ultraschall- oder endokrinologischer Untersuchungen. Allen gebräuchlichen klinischen und daheim durchzuführenden Methoden gemein sei jedoch, schreibt Ong, dass sie eben nur einen einzigen Zeitpunkt bewerteten. Ihnen fehle das Vermögen, „Veränderungen im hormonellen Stoffwechsel über die Zeit hinweg zu quantifizieren“, was es erleichtern würde, generelle Aussagen über die Fruchtbarkeit zu treffen. Noch gibt es viele offene Fragen hinsichtlich der Ovulation und der physiologischen Gegebenheiten sowie über zeitlich limitierende Faktoren. Die richtigen Antworten darauf zu finden, könnte helfen, einen wichtigen Beitrag zu leisten, die Reproduktionsfitness der Frau positiv zu beeinflussen, ist Ong überzeugt.

Analytisches Set-up für Metabolismus-Studie gesucht

Um zu verstehen, was für die Entwicklung eines Lösungsansatzes erforderlich ist, braucht es Methoden, mit denen sich Reproduktionshormone sowie die ihrem Stoffwechsel entstammenden Metaboliten in Echtzeit über die Dauer der reproduktiven Jahre einer Frau bestimmen lassen, beschreibt es Ong in Ihrer Masterarbeit [2]. Die Beurteilung der Gesamtheit aller Metaboliten in biologischen Proben (Metabolomics) habe sich bereits in anderen Fällen zur Diagnose hormonell bedingter Erkrankungen als sinnvoll und nützlich herausgestellt.

Eine Metabolismus-Studie verlangt den Einsatz eines Analysenverfahrens, das es ermöglicht, die statistisch relevante große Zahl biologischer Proben, in denen sich die potenziell flüchtigen Metaboliten befinden, auf effiziente und zeitlich akzeptable Weise zu vermessen [3]. Als geeignet erweisen sich Urin, Speichel und Blut. Ong wählte als Probenbasis Harn, der sich auf einfachste Weise und ohne den Probengeber über Gebühr zu belasten in hinreichend großer Menge gewinnen lässt. Extrahiert wurde mittels automatisierter Festphasenmikroextraktion (SPME), für die Analyse kam ein GCxGC-TOF-MS-System zum Einsatz.

Blick auf die verschiedenen analytischen Schritte

Zur Entwicklung einer ersten Datenbasis sammelte Ong über 28 Tage täglich Urinproben von zehn Frauen im Alter von 18 bis 28 Jahren unterschiedlicher Herkunft; keine der Probandinnen nahm die Pille oder andere Medikamente, die das Hormongleichgewicht hätten stören und die Analysenresultate verfälschen können. Ziel war es, die flüchtigen Verbindungen, die mit den Sexualhormonen korrelieren, im Verlauf eines ganzen Menstruationszyklus zu monitoren. Vor der Probennahme (Mittelstrahlurin), die unter maximal sterilen Bedingungen erfolgte, durften die Frauen zwei Stunden lang keine Nahrung zu sich nehmen. Die Proben wurden innerhalb von vier Stunden nach der Probennahme aliquotiert und in tiefkühltauglichen Vials bei -80 °C gelagert.

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Abb 2: Detail eines GC/MS-Systems mit Gerstel-Multi-Purpose-Sampler (MPS), wie in der beschriebenen Metabolismus-Studie verwendet.
Abb 2: Detail eines GC/MS-Systems mit Gerstel-Multi-Purpose-Sampler (MPS), wie in der beschriebenen Metabolismus-Studie verwendet.
(Bild: Gerstel)

Um Kontaminationen zu vermeiden, die das Ergebnis der Messung hätten beeinträchtigen oder verfälschen können, verwendete Ong für die Analyse VOC-freie mit PTFE/Silikon-Kappen verschlossene 10-mL-Vials, die zuvor getrennt zwölf Stunden bei 100 °C gelagert wurden, um den VOC-Hintergrund zu reduzieren. Etwa eine Stunde vor der Analyse wurden sie auf Raumtemperatur gebracht und mit einem Milliliter der kurz zuvor gemixten Probe beschickt. Die Vials wurden verschlossen und auf dem gekühlten Probenteller des verwendeten Analysenroboters (Gerstel-Multi-Purpose-Sampler, MPS) bei 4 °C bis zur Analyse aufbewahrt. Bei 60 °C wurden die Urinproben dann fünf Minuten lang mit 250 U/min geschüttelt und inkubiert. Die Extraktion der flüchtigen Metaboliten aus dem Dampfraum über der Probe erfolgte mittels SPME unter Verwendung einer mit 30/50-µm-DVB/CAR/PDMS beschichteten Faser. Vor jeder Probenextraktion wurde die Faser zehn Minuten lang bei 270 °C ausgeheizt. Extrahiert wurde bei 60 °C für die Dauer von 60 Minuten, wobei die Probe gleichzeitig mit 250 U/min geschüttelt wurde. Anschließend wurde die Faser für fünf Minuten bei 250 °C im GC-Eingang positioniert und Analyten auf die GC-Säule überführt. Sämtliche Schritte der Probenvorbereitung bis zur Probenaufgabe wurden vom MPS automatisiert ausgeführt.

Ong führte die Trennung der Analyten unter Einsatz eines zweidimensionalen Säulensatzes (GCxGC; Restek) aus (Säule 1: Rxi-624Sil MS [60 m x 250 µm x 1,4 µm], Säule 2: Stabilwax [1 m x 250 µm x 0,5 µm]). Die Säulen wurden unabhängig voneinander aufgeheizt. Das Temperaturprogramm von Säule 1 gestaltete sich wie folgt: 50 °C (2 min) – 5 °C/min – 225 °C (2 min) – 30 °C/min – 230 °C (30 min); Säule 2: Die zweite Säule wurde mit einer Verschiebung von 5 °C relativ zum Primärofen aufgeheizt. Die Detektion erfolgte mit einem Time-of-Flight-Massenspektrometer (TOF-MS/MS). Ein Quad-Jet-Modulator wurde mit 2-s-Modulationsperioden (0,5 s heiße und 0,5 s kalte Pulse) verwendet und einem 15 °C-Versatz relativ zum Sekundärofen. Als Trägergas wurde Helium mit einem Fluss von 2 mL/min eingesetzt. Die Massenspektren wurden erfasst bei 100 Hz über einen Bereich von m/z = 35 bis 550. Die Datenerfassung erfolgte mit der Chroma-TOF-Software (Leco), berichtet Ong.

Gute Resultate und eine Basis für weitere Forschung

Die oben beschriebenen Methodenparameter insbesondere hinsichtlich des eingesetzten Probenvolumens und der Extraktionsdauer hat Ong nach eigenen Angaben vor Beginn der eigentlichen Messung optimiert. Die Methode wurde von ihr täglich kalibriert. Insgesamt identifizierte Ong im Urin der Probandinnen 935 unterschiedliche Analyten. Darunter waren zehn Verbindungen, die sich im Urin aller Probandinnen befunden haben und die sich nach entsprechender statistischer Auswertung als Schlüsselanalyten für den weiblichen Menstruationszyklus bezeichnen lassen.

Namentlich handelt es sich unter anderem um O-Cymen, 4,7-Dimethybenzofuran, 3-Octen-2-on, Butylcyclobutan, 2,2-Dimethylbutanal sowie 2-Hexylfuran, die insbesondere in der fruchtbaren Zeit einen deutlichen Anstieg gezeigt haben und damit potenziell als Biomarker für die Fruchtbarkeit der Frau herangezogen werden können bzw. die eine statistische Signifikanz zeigen in Korrelation zu hormonellen Veränderungen, schreibt Ong. Künftig sollen die zehn Schlüsselverbindungen bei der Untersuchung unabhängiger Datensätze validiert und auf ihre Robustheit untersucht werden.

Literatur:

[1] Janek S. Lobmaier, Urs Fischbacher, Urs Wirthmüller, Daria Knoch: The scent of attractiveness: Levels of reproductive hormones explain individual differences in women’s body odour. Proceedings of the Royal Society B, 12. September 2018, doi:10.1098/rspb.2018.1520, http://rspb.royalsocietypublishing.org/lookup/doi/10.1098/rspb.2018.1520

[2] Stephanie Marie Ong, Comprehensive Analysis of Volatile Biomarkers for Female Fertility, Arizona State University, May 2018, https://repository.asu.edu/attachments/201413/content/Ong_asu_0010N_17996.pdf

[3] Guido Deußing, Automatisierte Massenanalyse – Epidemiologische Probensätze auf dem Prüfstand, Laborpraxis 9 (2016) 64-66, www.laborpraxis.vogel.de/epidemiologische-probensaetze-auf-dem-pruefstand-a-550970/

* G. Deußing: Redaktionsbüro Guido Deußing, 41464 Neuss

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