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HPLC mit Leitfähigkeitsdetektion

Krankheitsauslöser Darmflora: Organische Säuren als diagnostische Marker?

| Autor / Redakteur: Dr. Isabelle Spenner* / Dr. Ilka Ottleben

Entwicklung einer analytischen Trennmethode für organische Säuren

Im vorliegenden Beispiel werden unter anderem Phosphorsäure, Bernsteinsäure, Milchsäure von verschiedenen aliphatischen organischen Säuren als Standards für die Charakterisierung der Darmflora von Mäusen herangezogen. In Abbildung 2 ist das Chromatogramm der entsprechenden verwendeten Standardlösungen bei 10 µl Injektionsvolumen dargestellt.

Die Analyse erfolgte auf einem Organic-Acids-Analysesystem von Shimadzu. Dabei werden zwei hintereinander geschaltete Ionenaustauschersäulen Shim-pack SCR-102H (300 mm L x 8,0 mm ID) verwendet und die isokratische Trennung erfolgt mittels einer 5 mmol/l Lösung von p-Toluensulfonsäure bei einer Flussrate von 0,8 ml/min bei 45 °C. Die Detektion konnte durch die Ladung der Säuren einfach per Messung der Leitfähigkeit durchgeführt werden.

Nach Entwicklung der Methode wurde die Linearität der Analyse getestet. Dazu wurde eine Kalibration im Konzentrationsbereich zwischen 0,1 bis 2,0 mmol/l erstellt. Für alle Verbindungen konnte dabei eine hervorragende Linearität mit einem Bestimmtheitsmaß R2 größer 0,999 gefunden werden. Exemplarisch ist die Kalibrationsgerade für Milchsäure in Abbildung 5 (s. online) dargestellt.

„Proof-of-Concept“: Analyse von Realproben

Für die Anwendung auf Realproben waren einige Probenvorbereitungsschritte notwendig, um die entsprechenden Komponenten von Interesse aus den Fäkalien von Mäusen extrahieren zu können. Die Proben wurden von einer bestimmten Mauszüchtung (C57BL/6J) unter standardisierten Bedingungen gesammelt und 50 mg frischer Mäusekot wurde in phosphatgepufferte Kochsalzlösung suspendiert. Lässt sich eine gleichmäßige Suspension nicht direkt erzeugen, kann die Probe für eine bessere Homogenisierung zunächst gemörsert werden. Der Überstand des Gemisches wurde per Zentrifugation abgetrennt und per Ultrafiltration aufgereinigt. Eine schematische Darstellung der gesamten Probenvorbereitung ist in Abbildung 3 gezeigt.

Anschließend wurden 10 µl der Probe entsprechend der entwickelten HPLC-Methode vermessen. Im Extrakt des Mäusekots konnten sieben der Standards detektiert werden, darunter auch Essigsäure und Ameisensäure, die nur schwierig mittels LCMS zu bestimmen sind. Das Chromatogramm dieser Trennung ist in Abbildung 4 dargestellt. Die detektierten Verbindungen wurden ebenfalls quantitativ bestimmt und es wurden Gehalte zwischen 0,07 mmol/l an Bernsteinsäure bis zu 2,69 mmol/l für Essigsäure und sogar 7,88 mmol/l Phosphorsäure festgestellt.

Schnelle, einfache Analyse organischer Säuren

Der menschliche Darm ist mit einer Vielzahl unterschiedlicher Mikroorganismen besiedelt, die in einem empfindlichen und komplexen Gleichgewicht stehen. Die Metaboliten dieser Bakterien, meist in Form organischer Säuren, haben einen großen Einfluss auf die menschliche Gesundheit und sind daher ein relevantes Forschungsgebiet der modernen Medizin und wichtiger Indikator in der Diagnose verschiedener Erkrankungen.

Die hier gezeigte Bestimmung organischer Säuren in der Darmflora mittels HPLC mit Leitfähigkeitsdetektion bietet eine schnelle und einfache Analytik selbst für kurzkettige organische Säuren, die mit massenspektrometrischen Verfahren nur schwer analysiert werden können. Auf diese Weise bietet das Verfahren ein einfaches Monitoring relevanter Verbindungen mit einer hervorragenden Linearität.

* Dr. Isabelle Spenner Shimadzu Deutschland GmbH, 47269 Duisburg

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