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SPECIAL PROBENVORBEREITUNG

Kurzkettige Fettsäuren in BAL - schneller Fingerprint mit SPME-GC/MS

17.05.2005 | Autor / Redakteur: HELMUT GEPPERT* / Marc Platthaus

Kurzkettige Fettsäuren sind Endprodukte der anaeroben bakteriellen Fermentation. Ihr Nachweis in Blutkulturen und Exsudaten legt die Vermutung nahe, dass bei einer bakteriellen Pneumonie auch Anaerobier für die Erkrankung verantwortlich sein können.

Kurzkettige Fettsäuren sind Endprodukte der anaeroben bakteriellen Fermentation. Ihr Nachweis in Blutkulturen (1) und Exsudaten (2) legt die Vermutung nahe, dass bei einer bakteriellen Pneumonie auch Anaerobier für die Erkrankung verantwortlich sein können. Diese werden mit Hilfe der konventionellen mikrobiologischen Untersuchungen nicht diagnostiziert. Als Alternative zur anaeroben Kultivierungwird ein Nachweis von kurzkettigen Fettsäuren in der Bronchoalveolarlavage (BAL) mit Hilfe derFestphasenmikroextraktion (SPME) vorgeschlagen (3).

Gerade in der Routinediagnostik von biologischen Proben spielt die Probenvorbereitung eine große Rolle. Aufgrund der Vielzahl der Proben, die bestimmt werden müssen, wird hier eine besonders schnelle und einfache Probenvorbereitung benötigt. Für die Analyse von kurzkettigen Fettsäuren ist die Festphasenmikroextraktion die Methode der Wahl. Diese können dabei entweder nach vorausgehender Derivatisierung in der wässrigen Phase [4-7] oder underivatisert in einer Mikrofaser angereichert werden. Bei der Anreicherung der undervatisierten Säuren ist der Einsatz einer Carboxen-PDMS-Faser von Vorteil [8]. Die in der Faser befindlichen Säuren können wiederum direkt im Injektor des GC desorbiert [2,8-10] oder vor der Injektion in der Faser derivatisiert werden [11,12].

In diesem Beitrag wird eine neue Derivatisierungsmethode - die Silylierung der in der Faser angereicherten kurzkettigen Fettsäuren mit MTBSTFA - vorgestellt.

Kinetik der SPME-Anreicherung und in-Faser-Silylierung mit MTBSTFA

Wie bereits durch Untersuchungen von Abalos u.a. [8] bekannt, wird bei Raumtemperatur und Verwendung einer 75 µm-Carboxen-PDMS-Faser auch nach einer Anreicherungszeit von 90 Minuten das Gleichgewicht nicht erreicht. Zweckmäßig ist deshalb eine kürzere Anreicherung bei erhöhten Temperaturen. Hier wurden die von Julak u.a. [2] publizierten Anreicherungsbedingungen verwendet. Untersuchungen zur Abhängigkeit der Peakflächen der TBDMS-Ester von der Zeit der Exposition der Faser im Dampfraum des Reaktionsvials ergaben, dass bereits 15 Minuten bei Raumtemperatur ausreichend sind, um die maximale Derivatisierung zu erreichen. Analoge Ergebnisse wurden auch bei der in-Faser-Silylierung von aciden Pharmaka publiziert [13].

Kurzkettige Fettsäuren in einer BAL-Probe

Abbildung 1 zeigt das GC-MS-Chromatogramm einer BAL-Probe im Vergleich mit einem Standard. Wie der Abbildung 1 zu entnehmen ist, werden dabei 2-Methylbuttersäure (iv-1) und 3-Methylbuttersäure (iv-2) vollständig getrennt. Außerdem kann über die Größe des MTBSTFA-Peaks die Aktivität des Derivatisationsmittel kontrolliert werden.

Bezogen auf das RIC-Signal von 2-Methylhexansäure(IS) ergibt sich für die kurzkettigen Fettsäuren das in Abbildung 2 dargestellte Muster. Nach Julak u.a. [14] können die BAL-Proben nach ihrem Fettsäuremuster in drei Gruppen untergliedert werden:

-Gruppe 1: kurzkettige Fettsäuren positiv, enthält zwei oder mehrere Fettsäuren mit Konzentration größer als die 0,2-fache IS-Konzentration,-Gruppe 2: kurzkettige Fettsäuren möglich, enthält 1 Fettsäure mit Konzentration größer als die 0,2-fache IS-Konzentration oder zwei Fettsäuren mit Konzentrationen kleiner als die 0,2- bis 0,1-fache IS-Konzentration und-Gruppe 3: kurzkettige Fettsäuren negativ, alle Konzentrationen der Fettsäuren sind kleiner als die 0,1-fache IS-Konzentration. Bei Patienten mit Fettsäure-Muster der Gruppe 1 und 2 sollte eine mikrobiologische Untersuchung mit anaerober Kultivierung durchgeführt werden [2].Fazit: Durch die Silylierung der in der Mikrofascher angereicherten Fettsäuren wird eine stark verbesserte chromatographische Auftrennung der kurzkettigen Fettsäuren erreicht. 2- und 3-Methylbuttersäure werden vollständig getrennt und zusätzlich kann auch Ameisensäure quantifiziert werden. Zukünftig soll untersucht werden, ob bei der Verwendung von Atemkondensat(AKO) anstelle von BAL analoge Ergebnisse erzielt werden können.

Experimentelles

Probenvorbereitung

1ml BAL werden in ein 4ml Vial gegeben und 100 µl 0,77 mM 2-Methylhexansäure(IS) in 20%iger H3PO4 gelöst sowie 100 mg NaCl dazugefügt und gut durchgemischt. Für die SPME wurde eine 85 µm-Carboxen-PDMS-Faser verwendet. Dabei wurden die Fettsäuren bei 50 °C ohne Rühren 15 Minuten aus dem Dampfraum angereichert und anschließend im Gasraum eines 2ml Reaktionsvials, in dem sich 50 µl MTBSTFA befanden, 15 Minuten bei Raumtemperatur in der Faser silyliert.

Literatur[1] Julak, J., Rosova, V., Prochazkova-Francisci, E., Stranska, E. (1999): Klin. mikrobiol. inf. lek. 5: 262[2] Julak, J., Prochazkova-Francisci, E., Stranska, E., Rosova, V. (2003): J. Microbiol. Meth. 52:115[3] Julak, J., Stranska, E., Rosova, V., Dohnalova A. (2004): Klin. mikrobiol. inf. lek. 10:262[4] Lee, X.P., Kumazawa,T., Kondo, K., Sato, K., Suzuki, O. (1999): J. Chromatogr. B 734:155[5] Kim, J.K., Shiraishi, T., Fukusaki, E.-I., Kobayashi, A. (2003): J. Chromatogr. A 986:313[6] Clark, T.J., Bunch, J.E. (1997): J. Chromatogr. Sci. 35:209[7] Wittmann, Gy., Van Langenhove, H., Dewulf, J. (2000): J. Chromatogr. A 874:225[8] Abalos, M., Pawliszyn, J. (2000): J. Chromatogr. A 873:107[9] Yo, S.P. (1999): Chemosphere 38:823[10] Mills G.A., Walker, V. (2001): J. Chromator. B 753:259[11] Pan, L., Adams, M., Pawliszyn, J. (1995): Anal. Chem. 67:4396[12] Mills, G.A., Walker, V., Mughal, H. (1999): J. Chromatogr. B 730:113[13] Rodriguez, I., Carpinteiro, J., Quintana, J.B., Carro, A.M., Lorenzo, R.A., Cela, R. (2004): J. Chromatogr. A 1024:1[14] Julak, J., Stranska, E., Rosova, V., Spanel, P., Geppert, H. (2005): J. Microbiol. Meth., in Vorbereitung

*H. Geppert, Hygiene- und Umweltinstitut Cottbus GmbH, 03050 Cottbus

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