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CHROMATOGRAPHIE

Zwei Tests zur Charakterisierung von RP-Phasen

03.05.2006 | Autor / Redakteur: Stavros Kromidas* / Marc Platthaus

Mithilfe von Tests können RP-Phasen recht gut charakterisiert werden. Neuere Tests liefern darüber hinaus Auskunft über die Homogenität der Phasenoberfläche und erlauben mit Hilfe von Normierungen sogar den direkten Vergleich von Säulen auch bei unterschiedlicher Dimensionierung und Eigenschaften.

Mithilfe von Tests, die in den letzten 10 bis 15 Jahren in der Literatur ausführlich beschrieben worden sind (u.a. von Sander, Tanaka, Engelhardt, McCalley, Euerby und Neue), können RP-Phasen recht gut charakterisiert werden. Neuere Tests liefern darüber hinaus Auskunft über die Homogenität der Phasenoberfläche und erlauben mit Hilfe von Normierungen sogar den direkten Vergleich von Säulen auch bei unterschiedlicher Dimensionierung und Eigenschaften.

Säulentests bedeuten in jedem Fall einen gewissen Aufwand, der sich jedoch für die Mehrzahl der Labors nicht lohnt. Der Informationsgewinn für den Anwender bzgl. Ähnlichkeit, Selektivitätsverhalten und „Güte“ von modernen RP-Säulen ist eher gering.

Solche Tests werden de facto in einigen Forschungslabors und bei Säulenherstellern durchgeführt. In letzterem Fall werden aus verständlichen Gründen häufig recht „milde“ Tests angewandt, so z.B. der Engelhardt-Test. Es gibt kaum eine moderne Säule die die Kriterien dieses oder eines ähnlich aufgebauten einfachen Tests nicht erfüllt.

Die Idee war nun, zu prüfen, ob es doch schnelle und einfache Tests gibt (isokratische Läufe, kein Puffer, Retentionszeit unter etwa 10-15 Min.), mit denen möglichst viele Informationen aus Anwendersicht gewonnen werden können. Die Daten aus früheren Messungen wurden mit Fokus auf die oben formulierte Forderung erneut geprüft.

Es scheint tatsächlich so zu sein, dass mit lediglich zwei einfachen HPLC-Läufen eine Reihe von Informationen gewonnen werden können - von der Säulencharakterisierung (hydrophober oder polarer Charakter) über die Zuordnung der Säulen zu Gruppen mit ähnlichen Eigenschaften bis hin zu deren Eignung für die Trennung bestimmter Analyttypen.

Um diese Feststellung zu verifizieren, wurden 25 neuere Säulen mit recht unterschiedlicher „Oberflächen-Chemie“ und damit unterschiedlichem chromatographischen Charakter ausgesucht und zusammen mit bereits untersuchten getestet - letztere als eine Art „interner Standard“. Für die zwei Tests bedarf es zweier Läufe und zweier Eluenten.

Test Eins mit dem Eluent 80/20 Methanol/Wasser, einem Fluss von 1 mL/min, einer Temperatur von 35 °C bei 245 nm Detektion und einer Injektion von Uracil (Inertmarker), Ethylbenzol und Fluorenon. Durch die Auftragung des Trennfaktors Ethylbenzol/Fluorenon wird der hydrophobe Charakter der Phasen sichtbar (s. Abb. 1). Phasen im linken Teil der Abbildung weisen einen hydrophoben Charakter auf (genauer: sie verfügen über eine gute hydrophobe Selektivität), Phasen im rechten Teil sind als polar zu bezeichnen.

Test zwei wird mit dem Eluent 40/60 Methanol/Wasser, einem Fluss von 1 mL/min, bie einer Temperatur von 35 °C, einer Detektion bei 254 nm und der Injektion von Uracil (Inertmarker), Phenol, Pyridin und Benzylamin durchgeführt. Je später in Test zwei das Benzylamin im Vergleich zu Phenol eluiert, desto stärker ist der polare Charakter der Phase (genauer: die Fähigkeit zu stark polaren/ionischen Wechselwirkungen).

Eine Koelution mit Phenol zeugt von einer hydrophoben, die Elution gar vor Phenol von einer sehr hydrophoben, gut abgedeckten RP-Oberfläche. Pyridin, eine wesentlich schwächere Base als Benzylamin wird lediglich zu Vergleichszwecken mitinjiziert. Als zweites Kriterium kann die Peakform von Benzylamin herangezogen werden, wobei hier betont werden muss, dass nur frisch angesetzte Lösungen injiziert werden sollten; das Injektionsvolumen sollte 10 µL nicht überschreiten. Das ist ein strenger Test. Nur an wenigen Säulen wird ohne Puffer eine wirklich gute Peaksymmetrie für Benzylamin festgestellt (s. Abb. 2 und 3)

In Abbildung 2 wird die Injektion von Uracil, polare Verunreinigung, Pyridin, Phenol, Benzylamin, unbekannte Verunreinigung an einer YMC Pro C18 gezeigt.

Abbildung 3 gibt die Injektion von Benzylamin an einer XBridge C18 wieder, die Peaksymmetrie ist gut, obwohl die Säule bewusst überladen wurde. Die Auftragung des Trennfaktors Ethylbenzol/Fluorenon (Y-Achse) gegen den Trennfaktor Ethylbenzol/Phenol (X-Achse) ergibt eine sog. Selektivitätskarte: Die Säulen können in drei Gruppen mit ähnlichem Charakter und damit ähnlichen Eigenschaften bzgl. Selektivitätsverhalten eingeteilt werden (s. Abb. 4).

Der hydrophobe Charakter kommt z.B. durch eine starke Belegung, eine divalente/trivalente Bindung der Alkylkette oder eine Polymerschicht zustande (A). Mittelpolare Phasen (B) weisen sowohl einen hydrophoben als auch einen polaren Charakter auf. Der polare Charakter dieser Phasen ergibt sich z.B. durch eine bewusst geringe Belegung und/oder durch polare Gruppierungen an der Oberfläche bzw. an der Alkylkette. Der für polare Phasen charakteristisch stark polare Charakter (C) ist das Resultat von z.B. kurzen Alkylketten, von polaren/ionischen Gruppen an der Oberfläche oder von (einer) eingebauten polaren/ionischen Gruppe(n) in der Alkylkette.

Anwendung einer Selektivitätskarte

Wird beispielsweise bei einer Trennung mit einer Säule aus der Gruppe A eine mangelnde Selektivität festgestellt, so sollte bei einem erneuten Versuch eher nicht eine Säule getestet werden, die sich auf der Selektivitätskarte in unmittelbarer Nähe dieser Säule befindet. Vermutlich hat sie ähnliche Eigenschaften und sie wäre für diese Substanzklasse u.U. ebenso wenig geeignet, die Chancen mit einer Säule aus der Gruppe B oder C mit diametral anderen Eigenschaften wären wahrscheinlich besser. Somit können mithilfe zweier einfacher Läufe RP-Säulen charakterisiert werden:

Hydrophober Charakter und damit Selektivität gegenüber bestimmten Substanzklassen und die Ähnlichkeit gegenüber anderen RP-Säulen (Säulenvergleich).

Bei Zeitmangel kann auf die Erstellung der Selektivitätskarte verzichtet werden: Lediglich die Injektion von Ethylbenzol/Fluorenon bei 80/20 Methanol/Wasser und Phenol/Benzylamin bei 40/60 Methanol/Wasser reicht für manche Information durchaus aus:

Aus Abb. 1 ist der hydrophobe/polare Charakter der Phasen und damit indirekt deren Eignung für die Trennung bestimmter Substanzklassen ersichtlich. So sind z.B. polare Phasen selektiv bei der Trennung von: dissoziiert vorliegenden Säuren/Basen,stark polaren Metaboliten und Zersetzungsprodukten, "schwierigen“ Isomeren (Doppelbindungs-, Stellungsisomeren), mehrkernigen, hydrophoben Aromaten (bedingt) sowie von planaren/nicht planaren Molekülen.

Auch die Peakform von Benzylamin in Kombination mit der Elution gegenüber Phenol offenbart, ob die Säule über stark polare/ionische Gruppierungen auf der Oberfläche verfügt oder nicht. Test eins macht Sinn, wenn man bereit ist, mehrere Säulen zu testen. Er gibt den hydrophoben Charakter nicht als absolute Größe an, sondern man kann Säulen nur in direktem Vergleich sehen. Oder man vergleicht im Falle einer neuen Säule den sich ergebenden Trennfaktor direkt mit den Zahlenwerten aus Abb. 1. Damit ist ein grober Vergleich der betroffenen Säule bzgl. des hydrophoben Charakters möglich.

Test zwei dagegen kann auch für einzelne Säulen angewandt werden. Elution von Benzylamin nach Phenol ist der Hinweis auf einen polaren Charakter der Phase, eine Koelution mit oder gar Elution vor Phenol wird dagegen bei hydrophoben, gut abgedeckten Phasen beobachtet. Letztere Phasen wären die erste Wahl für die Trennung von neutralen Komponenten, die sich in ihrem hydrophoben Charakter unterscheiden. Solche Säulen zeigen darüber hinaus eine gute Langzeitstabilität und wären für Routinemethoden vorzuziehen - sofern ihre Selektivität durch „cross-Experimente“ bestätigt wurde.

*Dr. S.Kromidas, saarbrücken

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