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Ionenaustauschchromatographie Ladungsvarianten von Biopharmazeutika sicher charakterisieren

Autor / Redakteur: Dr. Kyle D’Silva und Ken Cook* / Dr. Ilka Ottleben

Biotherapeutische Proteine wie monoklonale Antikörper (mAbs) sind heterogen und kommen als Gemisch von Molekülvarianten mit ähnlicher Struktur vor. Die Heterogenität von mAbs lässt sich z.B. mit der Ionenaustauschchromatographie erkennen. Änderungen des Ladungscharakters können sich signifikant auf Struktur, Stabilität, Bindungsaffinität und Wirksamkeit der Biopharmazeutika auswirken.

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Abb. 1: Chromatographische Medien für Kationenaustauscher (Ausschnitt)
Abb. 1: Chromatographische Medien für Kationenaustauscher (Ausschnitt)
(Bild: Thermo Fisher Scientific)

Therapeutische Proteine wie monoklonale Antikörper (mAbs) sind außerordentlich komplex und erfordern zur Überprüfung ihrer Struktur eine Vielzahl physikalisch-chemischer Tests. Ist die Struktur erst einmal validiert, muss sie von der Entwicklung über die Herstellung bis zur Vermarktung kontinuierlich überwacht werden, um die Sicherheit und Wirksamkeit des Medikaments zu gewährleisten. Regulatorische Richtlinien wie ICH Q6B konzentrieren sich auf die Analyse der Kernstruktur und der physikalisch-chemischen Eigenschaften, die für die Hersteller der Präparate erforderlich sind, um die wie ein Fingerabdruck unverwechselbare strukturelle Gleichartigkeit ihres Kandidatenmoleküls bei der Klonselektion, Prozessentwicklung und letztlich für die Stabilität des produzierten Medikaments nachzuweisen. Als kritische Qualitätsattribute (Critical Quality Attributes, CQAs) der Moleküle gelten Eigenschaften, die ihre klinische Sicherheit oder Wirksamkeit betreffen. CQAs werden mithilfe von Analysen kontrolliert, die dazu dienen, die Variabilität zwischen den einzelnen Chargen zu minimieren. Hierzu gehören u.a.:

  • Ladungsvarianten-Charakterisierung,
  • Aggregatanalyse,
  • Glycan-Analyse,
  • intakte Massenanalyse und
  • Peptid-Mapping.
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Ladungsheterogenität von Proteinen – warum so wichtig?

Ladungsvarianten können in therapeutischen Proteinprodukten aus vielerlei Gründen auftreten, einschließlich Sequenzänderungen, posttranslationaler Modifizierung und chemischer Abbauvorgänge. Die häufigsten Ursachen von Ladungsvarianten sind Deamidierung, Isomerisierung, Succinimid-Bildung, Oxidation, Sialinsäurebildung, Pyroglutamat-Bildung am N-Terminus, C-terminale Lysin-Abspaltung und Aggregation. Je nach Art der Modifizierung kann die sich ergebende Spezies saurer oder basischer als das mAbs-Hauptmonomer sein. Da diese Änderungen die Stabilität und biologische Aktivität des Produkts beeinflussen können, stellt Ladungsheterogenität eine Herausforderung für den Nachweis der Vergleichbarkeit dar.

Für potenziell innovative Biologika oder Biosimilars müssen jegliche Abweichungen zügig identifiziert und so frühzeitig wie möglich minimiert werden. Zu den Prozessmaßnahmen können die weitere Optimierung der Zellkulturbedingungen oder die Weiterentwicklung der Formulierungen gehören.

Ein schnelles und sicheres Programm zur Charakterisierung von Ladungsvarianten kann die Kandidaten-Entwicklung beschleunigen und Strategien zur effizienten, kontinuierlichen Kontrolle unterstützen.

Therapeutische Ladungsvarianten trennen

Ionenaustauschchromatographie (IEC) wird weithin als der Goldstandard für die Analyse von Biomolekülen genutzt und bleibt weiterhin eine Schlüsseltechnologie für die Ladungsvariantenanalyse. Bei der Ionenaustauschchromatographie werden Moleküle anhand von Ionengruppen auf der Proteinoberfläche getrennt, die sich in elektrostatischer Wechselwirkung mit entgegengesetzt aufgeladenen Ionengruppen an der Oberfläche der stationären Phase befinden:

  • Als Anionenaustauscher eingesetzte Säulen verfügen über eine positiv geladene stationäre Phase und werden oberhalb des isoelektrischen Punkts (Isoelectric Point, PI) des Proteins betrieben.
  • Als Kationenaustauscher eingesetzte Säulen enthalten negativ geladene Gruppen, die auf eine stationäre Phase in Polymerform gepfropft werden (s. Abb. 1). Sie werden bei pH-Werten betrieben, die unterhalb des PI des Proteins liegen. Kationenaustauschchromatographie wird gewöhnlich für die Analyse von monoklonalen Antikörpern (mAbs) eingesetzt, da hier aufgrund des hohen Anteils an basischen Rückständen der Einsatz von basischer Oberflächenchemie angeraten ist. Saure Varianten werden von der stationären Phase in geringerem Maße zurückgehalten und zuerst eluiert; ihnen folgen die neutralen und schließlich die basischen Varianten (s. Abb. 2).

Viele der häufig verwendeten Chromatographieverfahren wie die Umkehrphasen-Chromatographie (Reverse Phase, RP), arbeiten mit organischen Lösungsmittel, die das Zielprotein denaturieren oder entfalten und es von seinem eigentlichen nativen Zustand entfernen. Ein Vorteil der Ionenaustauschchromatographie besteht darin, dass es bei der Trennung nicht zu einer Denaturierung kommt. Die Elution erfolgt unter Verwendung eines Salz- oder pH-Gradienten, um die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen dem Protein und der stationären Phase zu unterbrechen.

Trennung: Vergleich von Salz- und pH-Gradienten

Traditionell wurde die Proteintrennung gewöhnlich mithilfe von Salzgradienten durchgeführt. Eines der Hauptprobleme beim Verwenden von Salzgradienten ist, dass für jedes einzelne Zielproteinmolekül ein individueller Gradient entwickelt werden muss. Darüber hinaus hatte die Empfindlichkeit von Salzgradienten gegenüber genauen Ionenkonzentrationen einschließlich des Proteins selbst zur Folge, dass zum Erreichen einer akzeptablen Wiederholbarkeit lange Säulen und flache Salzgradienten erforderlich waren. Dementsprechend war es um die Wiederholbarkeit und Robustheit bei schnellen Verfahren häufig schlecht bestellt, einschließlich der zeitraubenden Verfahrensentwicklung, die für jedes Kandidatenmolekül wiederholt werden musste.

2009 veröffentlichte Genentech zum ersten Mal die Verwendung von pH-Gradienten anstelle von Salzgradienten zum Trennen von Ladungsvarianten. Der Vorteil pH-basierter Gradienten liegt darin, dass diese Methode weltweit auf jeden beliebigen mAb anwendbar ist und somit das Entwicklungsverfahren erheblich vereinfacht. Es wurde festgestellt, dass mAbs mit isoelektrischen Punkten im Bereich von ungefähr 7 bis 9 mithilfe von Kationenaustauschersäulen, die im pH-basierten Elutionsmodus betrieben werden, ausgezeichnet getrennt werden können. Damit bot sich ein universellerer Ansatz, der eine einzige Methode zum problemlosen Trennen unterschiedlicher Ladungsvarianten in einem Bereich von Antikörpern bot. Auch die Analysedauer konnte durch das Verwenden von pH-Gradienten anstelle von herkömmlichen Salzgradienten mit Ionenstärke erheblich verringert werden (von 90 Minuten auf fünf bis 20 Minuten).

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Der Vergleich der Elutionsreihenfolgen der Versuche mit salz- und pH-basierten Gradienten hat gezeigt, dass die mAb-Varianten unter beiderlei Rahmenbedingungen gewöhnlich in ähnlicher Reihenfolge eluiert werden (s. Abb. 2). Normalerweise sorgen jedoch pH-Gradienten für eine bessere Auflösung von mAb-Varianten (s. Abb. 3).

Verbesserte mAb-Trennung mit generischen Plattformverfahren

Bei der Verfahrensoptimierung für salzbasierte Gradienten wurde normalerweise die im Folgenden dargestellte Vorgehensweise eingehalten (s. LP-Tipp: Entwicklungsprozess 1). Häufig wird zusätzlicher Arbeitsaufwand erforderlich, um das Salzgradienten-Verfahren auf die einzelnen Ladungsvarianten abzustimmen. Ein ausreichend optimierter Salzgradient bietet zwar eine hervorragende Leistung, Spitzenkapazität und Auflösung, das Optimieren und Übertragen der Verfahren bindet jedoch Ressourcen. Dies gilt insbesondere für in der Auftragsforschung tätige Unternehmen, die derartige Analysen für mehrere Kunden an Dutzenden von ähnlichen mAbs durchführen.

Ergänzendes zum Thema
LP-Tipp – Entwicklungsprozess 1 – Salz

Entwicklungsprozess 1 – Salzgradienten-Verfahren für mAbs – 1 Woche. 1. Vorbereitung (ein Tag):

  • Vorbereiten einer Reihe von Pufferlösungen mit unterschiedlichen pH-Werten und Salzgradienten-Lösungen.

2. Optimieren des pH-Werts von Salzgradienten für eine möglichst große Anzahl an Varianten (zwei Tage):

  • Testweise Elution des Zielproteins mit unterschiedlichen pH-Werten, Pufferlösungen und einem definierten Salzgradienten.
  • Hierzu sind gewöhnlich mehr als zehn Testdurchläufe erforderlich, jeder von etwa 60 Minuten Dauer.
  • Daten auswerten und den pH-Wert auswählen, der die maximale Anzahl an Varianten ermöglicht.

3. Salzgradienten optimieren (ein bis zwei Tage):

  • Elution des Zielantikörpers bei optimiertem pH-Wert testen.
  • Hierzu sind gewöhnlich zehn Testdurchläufe erforderlich, jeder von etwa 45 bis 60 Minuten Dauer.
  • Salzgradienten zum Optimieren des Zeitaufwands gegenüber der Auflösung auswählen.

4. Wiederholen für alle in Frage kommenden mAbs (etwa fünf Tage):

  • Die Begründung dafür ist, dass jeder mAb und seine Varianten unterschiedliche isoelektrische Punkte haben und sowohl für den pH-Wert wie auch für den Salzgradienten einzeln optimiert werden müssen.

Mit pH-Gradientenpuffern und Kits, wie dem in Abbildung 2 verwendeten pH-Gradientenpuffer-Kit CX-1 von Thermo Scientific, lassen sich mithilfe der Kationenaustauschchromatographie weitgehend reproduzierbare, lineare pH-Gradienten entwickeln. Dieses universell einsetzbare LC-basierte Plattformverfahren spart Zeit und ermöglicht die Verfahrensübertragung zur Qualitätssicherung und -kontrolle für ein umfangreiches Spektrum an mAb-Ladungsvarianten. Im Gegensatz zu herkömmlichen Salzgradienten lässt sich der PI aufgrund der Retentionszeit der Ladungsvarianten und einem schmalen pH-Bereich prognostizieren, um Trennungen mit hoher Auflösung zu gewährleisten.

Die Bausteine der pH-Gradientenpuffer-Plattform CX-1 sind zwei aus mehreren Komponenten bestehende zwitterionische Pufferkonzentrate, die mithilfe einer patentierten Formulierung hergestellt werden. Pufferlösung A ist bei pH 5,6 titriert, Pufferlösung B bei pH 10,2. Als Pufferlösung kommen zwitterionische und daher in diesem pH-Bereich neutrale „Good“-Puffer zum Einsatz; diese werden daher von der stationären Phase der Kationenaustauschersäule nicht gebunden.

Für die pH-Gradienten-Pufferanalyse kann ein linearer Gradient von pH 5,6 bis pH 10,2 mithilfe eines linearen Pumpengradienten von 100% Puffer A (pH 5,6) zu 100% Puffer B (pH 10,2) generiert werden; hierdurch wird die Analyse der mAb-Ladungsvarianten universell anwendbar und zum Verbessern der Trennleistung problemlos optimierbar, wodurch sich ein besseres Trennverfahren für Ladungsvarianten ergibt als beim Salzgradienten-Verfahren (s. Abb. 3). Die hier beschriebenen Methoden wurden bereits für die Entwicklung von Biosimilaren im Vergleich zu einigen der meistverkauften mAbs vorgestellt (s. LP-Tipp: Entwicklungsprozess 2).

Ergänzendes zum Thema
LP-Tipp – Entwicklungsprozess 2

Entwicklungsprozess 2 – pH-Gradienten-Verfahren für mAb – zwei Stunden.

1. Vorbereitung (fünf Minuten):

  • Herstellen einer 1:10 Verdünnung des pH-Gradientenpuffer-Kits CX-1.

2. Ermitteln des Elutionsprofils mithilfe des Plattform-pH-Gradienten-Verfahrens (30 Minuten):

  • Verwenden des Standard-Plattformgradienten für mAb, 0 bis 100% B.

3. Optimieren für Geschwindigkeit und Trennung (90 Minuten):

  • Verwenden eines flacheren pH-Gradienten über einen enger gefassten pH-Bereich zum Eluieren der Varianten. Das chromatographische Profil und somit die Elutionsreihenfolge der Varianten bleibt weiterhin prognostizierbar, wenn ein flacherer pH-Gradient verwendet wird. Gewöhnlich sind hierzu je nach Protein fünf Durchläufe von jeweils zehn bis 20 Minuten erforderlich.

Es kann schnell gehen oder auch ultraschnell

Die Verfahrensoptimierung mithilfe von pH-Gradientenpuffern ist schnell und erfordert häufig nur wenige Stunden. Die Kombination mehrerer neuer Techno­logien in einem einzigen Arbeitsablauf hat es Wissenschaftlern ermöglicht, den Maßstab für das schnelle, sichere Charakterisieren von Ladungsvarianten höher anzusetzen [7]: Die dargestellte ultraschnelle Trennung von Ladungsvarianten (s. Abb. 4) wird aufgrund mehrerer Fortschritte bei den Chromatographieverfahren möglich.

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Der Mechanismus der pH-Gradienten-Chromatographie an sich trägt zum Einsatz kürzerer, schnellerer Säulen mit geringeren Teilchengrößen bei. Die hier verwendeten handelsüblichen Puffer erzeugen einen linearen Gradienten, der eine intelligente Verfahrensoptimierung ermöglicht. Und schließlich ermöglichen UHPLC-Weiterentwicklungen außerordentlich geringe Totvolumen, eine hochpräzise Gradientenbildung und einen absolut inerten Flusspfad; aus diesen Vorteilen ergibt sich ein lückenloser Analysezyklus im Bereich von zwei Minuten, einschließlich erneuter Säulenäquilibrierung und Injektionszeit, wodurch der Benutzer im 48-stündigen Dauerbetrieb mehr als 1400 Proben bearbeiten kann.

Danksagungen: Die Autoren möchten Amy Farrell, Craig Jakes, Stefan Mittermayr, Silvia Millan Martin und Jonathan Bones vom National Institute for Bioprocessing Research and Training (NIBRT), Dublin/Irland für ihre freundliche Bereitstellung einiger der in diesem Artikel verwendeten Daten und Praktiken danken. Weiterer Dank geht außerdem an Shanhua Lin, Chris Pohl, Manish Singh, Sachin Pandey und Mauro De Pra von Thermo Fisher Scientific für die hier präsentierten Anwendungen und Daten.

Referenzen:

[1] www.ich.org/products/guidelines/quality/article/quality-guidelines.html

[2] Thermo Scientific Apps Lab – 3734 – Charge Variant Analysis of NIST mAb

[3] Farnan, D., and Moreno, G., Anal. Chem., 2009, 81 (21), pp 8846–8857

[4] Thermo Scientific Application Note 21565 - The advantage of pH gradient buffers is demonstrated by the ion exchange separation of charge variants of denosumab

[5] www.thermofisher.com/chargevariants

[6] Thermo Scientific Application Note 21092 - High-Resolution Charge Variant Analysis for Top-Selling Monoclonal Antibody Therapeutics Using a Linear pH Gradient Separation Platform

[7] Thermo Scientific Technical Note 160 - Development of Ultra-fast pH-Gradient Ion Exchange Chromatography for the Separation of Monoclonal Antibody Charge Variants

* Dr. K. D’Silva, K. Cook: Thermo Fisher Scientific, Hemel Hempstead/UK

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