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MIKROSKOPIE & BILDANALYSE Langzeitbeobachtung lebender Zellen

Autor / Redakteur: Christoph R. Bauer* und Verena Nickl** / Gerd Kielburger

Bis zu drei Tage lang sind lebende Zellen zur Untersuchung zirkadianer Genexpression in der einzelnen Zelle kontinuierlich unter Beobachtung. Ein dauerhaft stabiler Fokus ist in Versuchsreihen wie diesen besonders wichtig. Darüber hinaus ist eine sehr kurze Belichtungsdauer vonnöten sowie optimale CO2-Werte und Befeuchtung der Klimakammer. Nur unter diesen Konditionen sind derart lange Experimente mit lebenden Zellen möglich.

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( Archiv: Vogel Business Media )

Bis zu drei Tage lang sind lebende Zellen zur Untersuchung zirkadianer Genexpression in der einzelnen Zelle kontinuierlich unter Beobachtung. Ein dauerhaft stabiler Fokus ist in Versuchsreihen wie diesen besonders wichtig. Darüber hinaus ist eine sehr kurze Belichtungsdauer vonnöten sowie optimale CO2-Werte und Befeuchtung der Klimakammer. Nur unter diesen Konditionen sind derart lange Experimente mit lebenden Zellen möglich.

Der Herzschlag, der Blutdruck, der Wach- und Schlafzustand, die Körpertemperatur, die Nierenaktivität und der Verdauungstrakt sowie auch Hormonveränderungen und der Sexualtrieb werden von zirkadianen Rhythmen gesteuert. Suprachismatische Neuronen im Gehirn sind die Kontrolleinheiten für zirkadiane Rhythmen im Körper von Menschen und Säugetieren.

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Licht beeinflusst die Funktionsfähigkeit der zentralen Uhr im Gehirn, die wiederum die Kontrolle über sämtliche periphere Uhren in den Organen übernimmt. Diese rhythmische Physiologie basiert auf negativen Feedback-Zyklen: Proteine werden dabei synthetisiert und regulieren ihre eigene Deaktivierung selbstständig in einem kontinuierlichen 24-Stunden-Rhythmus. Bei der Überschreitung verschiedener Zeitzonen beispielsweise werden zirkadiane Rhythmen gestört: Der sog. Jetlag tritt auf, der typische Symptome wie Ein- und Durchschlafstörungen oder Verdauungsstörungen mit sich bringt.

Die Arbeitsgruppe von Professor Ueli Schibler konnte in den neunziger Jahren zirkadiane Rhythmen in fibroblasten Zelllinien nachweisen [1]. Dabei wurden Zellen mittels stark verändertem Serumkonzentrat einem Schock ausgesetzt. In regelmäßigen Zeitabständen wurde daraufhin die Konzentration der Messenger-RNA bestimmter Proteine gemessen und quantifiziert. Anhand dieser Versuche konnte die Forschergruppe nachweisen, dass die Synthese dieser Proteine in fibroblasten Zelllinien einem 24-Stunden-Rhythmus folgt.

Die Experimente belegten jedoch keinen dauerhaften Rhythmus. Die Frage, ob zirkadiane Rhythmen ständig vorliegen oder nur der Schock diese ausgelöst hat, blieb zunächst unbeantwortet. Ausschließlich Einzelzelluntersuchungen können die gewünschten Antworten geben. Die Arbeitsgruppe von Professor Ueli Schibler an der Universität Genf hat die Experimente zur rhythmischen Proteinsynthese und Deaktivierung auf Einzelzellebene mit der Fluoreszenzworkstation Leica AF6000 LX durchgeführt. Dieses Mikroskopiesystem wurde speziell für Langzeitversuchsreihen konzipiert und schafft konstant Idealbedingungen für lebende Zellen. Die Resultate des Forscherteams bekräftigen, dass Langzeitbeobachtungen lebender Zellen auch zukünftig ein wichtiger Aspekt moderner biomedizinischer Forschung sein werden.

Untersuchungen auf Einzelzellebene

Um zirkadiane Genexpression in der einzelnen Zelle zu untersuchen, bildete Schibler mit Emi Nagoshi, Camille Saini, Christoph Bauer, Thierry Laroche und Felix Naef ein Forscherteam. Die Arbeitsgruppe von der Universität Genf untersuchte die rhythmische Proteinsynthese und Deaktivierung auf Einzelzellebene [2]. Dabei wurden die lebenden Zellen bis zu drei Tage lang mit der Fluoreszenzworkstation Leica AF6000 LX beobachtet. Dieses multidimensionale Bildanalysesystem besteht aus dem inversen Forschungsmikroskop Leica DMI6000 B, weiteren Hardwarekomponenten, Applikationssoftware und einer Auswahl an Kamerasystemen.

Für die Untersuchungen versetzten die Wissenschaftler die Zellkulturen mit dem besonders intensiv fluoreszierenden Marker Venus - einem Derivat von YFP. Eine PEST1-Sequenz sorgt dafür, dass die Proteine sehr schnell abgebaut werden. Anhand der Syntheserate der Proteine wird ermittelt, ob in Einzelzellen zirkadiane Rhythmen vorliegen. Die Profile der gelb fluoreszierenden Zellkerne zeigen an, ob zwischen Deaktivierung und Synthese tatsächlich eine Periodizität festzustellen ist - analog zu zirkadianen Rhythmen im Gehirn und in den Organen. Die Wissenschaftler beobachteten im Rahmen der Einzelzelluntersuchungen sowohl unbehandelte Zellpopulationen als auch solche, die einem Schock mit stark veränderter Serumkonzentration ausgesetzt wurden.

Stabilität ist für gelungene Experimente entscheidend

Grundvoraussetzung für Langzeitaufnahmen, wie die an der Universität Genf durchgeführten, ist ein sehr stabiles System. Während die Zellen bis zu drei Tage lang unter Beobachtung sind, muss ein Fokusdrift vermieden werden. Der speziell für Langzeitversuche entwickelte Stabilitätsmanager des Leica DMI6000 B vermeidet einen Drift des Fokus: Das inverse Forschungsmikroskop mit Klimakammer ermöglicht, die Temperatur optimal zu kontrollieren. Somit wird Thermoeffekten vorgebeugt, die Instabilität im Fokus verursachen können.

Um Phototoxizität oder ein Ausbleichen der Zellen zu unterbinden, muss die Belichtungsintensität gering und die Belichtungsdauer während der Aufnahmen möglichst kurz gehalten werden. Besonders wichtig war der Genfer Forschergruppe, dass die AF6000 LX Bildaufnahmen in Echtzeit durchführen kann, bei der Shutter und Belichtung auf die Millisekunde genau kontrolliert werden. Diese optimale Synchronisation sorgt dafür, dass nur dann belichtet wird, wenn Aufnahmen gemacht werden. Die Bedingungen eines Brutschranks sind ideal für die Aufnahme lebender Zellen über längere Zeiträume. Die Klimakammer der Leica AF6000 LX ermöglicht CO2-Kontrolle und Befeuchtung, sodass die Zellen denselben Konditionen ausgesetzt sind wie in einem Brutschrank.

Im Herbst 2004 schließlich konnten die sechs Forscher der Genfer Universität belegen, dass in Einzelzellen dauerhaft zirkadiane Rhythmen vorliegen. Der Zyklus zwischen Proteinsynthese und Deaktivierung wurde permanent in den Zellen nachgewiesen; die Rhythmen entstehen nicht durch den mit stark veränderter Zellkonzentration ausgelösten Schock.

Der Schock synchronisiert die Zellen, weshalb sich die Fluoreszenzprofile der Zellkerne im Anschluss an das Ereignis (s. Abb. 2a) für eine bestimmte Dauer angleichen. Bei unbehandelten Zellen sind die Profile nicht synchron (s. Abb. 2b), ein Rhythmus ist jedoch ebenfalls vorhanden. Schiblers Forscherteam konnte überdies nachweisen, dass die konstante Periodizität während der Zellteilung von der Mutterzelle an die Tochterzelle weitergegeben wird. Die entscheidenden Ergebnisse konnte das Team der Universität nur mithilfe der Leistungsfähigkeit der AF6000 LX luoreszenzworkstation gewinnen. Es war die Stabilität des Systems, die problemlose Langzeitaufnahmen lebender Zellen ermöglichte.

Zukunftsperspektiven der Experimente

Die von Schiblers Team gewonnenen Resultate eröffnen Krebsforschern und auch der Pharmaentwicklung neue Forschungsperspektiven. Durch Langzeitbeobachtung der zirkadianen Rhythmen in Verbindung mit Medikamenten können Forscher untersuchen, ob spezifische Präparate wirksamer sind, wenn sie zu bestimmten Tageszeiten verabreicht werden. Defekte im Zyklus zwischen Proteinsynthese und Deaktivierung sind mit Krebs assoziiert, weshalb die zirkadiane Genexpression in der einzelnen Zelle auch für die Krebsforschung neue Wege begründet. Für diese und andere zukünftige Untersuchungen im Zusammenhang mit zirkadianen Rhythmen im Einzelzellbereich ist die multidimensionale Fluoreszenzworkstation Leica AF6000 LX gut geeignet.

*Dr. C. R. Bauer, University of Geneva, 1211 Genf/Schweiz**V. Nickl, Leica Microsystems, 35778 Wetzlar

Literatur:[1] Balsalobre, A., Damiola, F., and Schibler, U. (1998). A Serum Shock Induces Circadian Gene Expression in Mammalian Tissue Culture Cells. Cell 93, 929-937.[2] Nagoshi, E., Saini, C., Bauer, C., Laroche, T., Naef, F. and Schibler, U. (2004). Circadian Gene Expression in Individual Fibroblasts. Cell 119, 693-705.

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