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Pflanzenschutzmittel im Grundwasser Large-Volume-Injection LC-MS/MS bei polaren PSM-Metaboliten

Autor / Redakteur: Sebastian Kowal, Peter Balsaa, Friedrich Werres, Torsten C. Schmidt* / Dr. Ilka Ottleben

Pflanzenschutzmittel (PSM) sollen an der Erdoberfläche bzw. auf der Pflanze wirken, dringen aber oft bis ins Grundwasser vor, das durch die Wirkstoffe und ihre Metabolite beeinträchtigt wird. Aufgrund ihres meist polaren Charakters erweist sich ihre Analytik als anspruchsvoll. Die Large-Volume-Injection LC-MS/MS hilft hier weiter.

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Die jahrelange Anwendung von Pflanzenschutzmitteln (PSM) u.a. in der Landwirtschaft beeinträchtigt auch die Grundwasserressourcen.
Die jahrelange Anwendung von Pflanzenschutzmitteln (PSM) u.a. in der Landwirtschaft beeinträchtigt auch die Grundwasserressourcen.
(Bild: © countrypixel - Fotolia.com)

Es ist bekannt, dass die jahrelange Anwendung von Pflanzenschutzmitteln (PSM) in der Landwirtschaft und auf kommunalen Flächen zu einer Beeinträchtigung der Grundwasserressourcen führt. Dabei gelangen nicht nur die PSM-Wirkstoffe selbst in den Grundwasserleiter, sondern auch ihre biologischen oder chemischen Metaboliten [1]. Die chemische Analytik der meist polaren Metaboliten erweist sich als schwierig, da klassische Extraktionsverfahren wie die Festphasen- oder Flüssig-flüssig-Extraktion sich häufig nicht eignen. Erst die neueren hochempfindlichen Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometer (LC-MS/MS) lassen die sichere Bestimmung solcher Substanzen mittels Direktinjektion im unteren ng/L-Bereich zu [2].

Jedoch müssen zur Empfindlichkeitssteigerung bei der Analytik von polaren Substanzen spezielle Techniken für die Direktinjektion großer Probenvolumen eingesetzt und optimiert werden. Ferner gelangen mit einem großen Probevolumen neben den Zielanalyten auch störende Matrixbestandteile bestehend aus Salzen und organischen Komponenten (DOC) in das MS. Die Matrixkomponenten sind deutlich höher konzentriert (mg/L bis g/L) als die Zielanalyten (ng/L bis µg/L) und beeinträchtigen bei Koelution die Elektrosprayionisation. Beim Einsatz der Umkehrphasenchromatografie treten diese Matrixeffekte häufig bei früh eluierenden polaren Zielsubstanzen auf, die mit der Salzfront koeluieren. Die Matrixeffekte stören oft die Quantifizierung mittels LC-MS und sollten in der Regel reduziert oder kompensiert werden [3].

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Der Matrixeinfluss wurde besonders bei der Messung der beiden stabilen Metaboliten Desphenyl-chloridazon (DCL) und Methyl-desphenyl-chloridazon (MDCL) des Herbizides Chloridazon beobachtet [4]. Die beiden PSM-Metaboliten sind mit einem Log-P-Wert von jeweils -0,84 und -0,62 sehr polar. Aufgrund der Polarität der Metaboliten lag der Fokus der Arbeit auf der Entwicklung und Optimierung einer geeigneten chromatographischen Methode und der weitergehenden Untersuchung der Matrixeffekte.

Methodenentwicklung und Optimierung

Die Untersuchungen wurden mittels eines Waters Acquity UPLC-TQD-Systems mit kurzen Sub-2-µm-Partikelsäulen (Umkehrphase) durchgeführt. Die chromatographische Trennung erfolgte über eine Waters Acquity UPLC Säule des Typs HSS C18 (2,1 x 50 mm x 1,8 µm), während die Detektion von zwei spezifischen Massenübergängen mittels des Tandem-Massenspektrometers durchgeführt wurde. Das Injektionsvolumen betrug 50 µL (etwa 40 % des Säulenvolumens). Ein nahezu wässriger Anfangsgradient (A: 99,9 % Wasser, 0,01 % Ameisensäure; B: 0,1 % Acetonitril) führte zur Fokussierung der Zielanalyten am Säulenkopf und damit zu einer Erhöhung der Retentionszeit (s. Abb. 1b). Eine Erhöhung des organischen Modifiers unmittelbar nach der Injektion führte zu symmetrischen Peaks ohne Peakverbreiterung (s. Abb. 1c), die in der Regel durch Injektion eines großen Probenvolumens (≥ 10 % des Säulenvolumens) auftritt (s. Abb. 1a).

Während der Untersuchung von Matrixeffekten konnte festgestellt werden, dass viele Salze und insbesondere Ammoniumionen eine deutliche Signalerhöhung verursachen. Daher wurden die Ammoniumionen während der Methodenentwicklung als Additive untersucht, um die Empfindlichkeit der analytischen Methode zu steigern. Eine ammoniakalische Lösung (10 mmol/L) wurde mittels eines T-Stücks und Spritzensystems zwischen der chromatografischen Säule und MS-Detektor infundiert. Hierbei konnte eine Erhöhung der Empfindlichkeit um den Faktor 10 erreicht werden.

Die Untersuchung von Matrixeffekten

Um den Einfluss der Matrixkomponenten auf die beiden Metabolite zu evaluieren, wurden Untersuchungen mit Modellwässern durchgeführt. Hierzu wurden die Zusammensetzung und Konzentrationen der Matrixkomponenten anhand von 600 Umweltproben (Oberflächen-, Trink-, und Grundwässer) ermittelt. Die Modellwässer wurden jeweils mit der höchsten Konzentration (95 %-Quantil) der jeweiligen Komponente und mit den beiden Metaboliten (jeweils 1 µg/L) dotiert. Zusätzlich wurden Verdünnungen (10 %, 50 %) der Modellwässer bei gleicher Metabolitenkonzentration gemessen. Die höchsten Konzentrationen der Umweltmatrix sind in der Tabelle 1 eingetragen.

Die Ergebnisse zeigen starke Matrixeffekte, die mit höherer Matrixkonzentration – bis zu einer Sättigung bei der maximalen Matrixkonzentration – zunehmen (s. Abb. 2a). Modellwässer mit zweiwertigen Kationen und Ammoniumionen weisen höhere Matrixeffekte als Natrium- oder Kaliumionen auf. DOC hat keinen Einfluss und wurde in der Abbildung nicht dargestellt. Folgernd kann angenommen werden, dass die Salzmatrix die Empfindlichkeit der analytischen Methode steigert und bei genügend hoher Matrixkonzen-tration im System eine Sättigung der Matrixeffekte auftritt. Dadurch sollte der Matrixeinfluss einer Probe auf die Quantifizierung reduziert werden können. Um diese Hypothese zu prüfen, wurde eine verdünnte ammoniakalische Lösung (als Ammoniumionenquelle) mittels der Nachsäuleninfusion, wie schon bei der Methodenentwicklung beschrieben zugeführt. Es wurde eine deutliche Empfindlichkeitszunahme bei einer gleichzeitigen signifikanten Erniedrigung der Matrixeffekte in den Modellwässern beobachtet (s. Abb. 2b). Obwohl die Matrixeffekte deutlich reduziert werden konnten, führte die Nachsäuleninfusion der ammoniakalischen Lösung nicht zu deren vollständigen Reduktion. Deshalb wurden die restlichen Matrixeffekte mittels isotopenmarkierter interner Standards kompensiert. Die Abbildung 2c zeigt die Ergebnisse der Kompensation der Matrixeffekte mittels des internen Standards. Der zusätzliche Einsatz der Nachsäuleninfusion führte auch hier zu einer signifikanten Erhöhung der Präzision der analytischen Methode (s. Abb. 2d). Daher wurde die Nachsäuleninfusion in der analytischen Routinemethode dauerhaft implementiert.

Allgemeine Anwendung in der Praxis

Die Fokussierung am Säulenkopf eignet sich besonders bei großvolumiger Injektion und Messung von polaren Substanzen, um eine höhere Retention auf dem Säulenmaterial bzw. Peaksymmetrie zu erhalten. Hier sollte jedoch darauf geachtet werden, dass die eingesetzten Säulen mit einem 100 % wässrigen Gradienten kompatibel sind. Die Nachsäuleninfusion einer ammoniakalischen Lösung (10 mmol/L) wurde auch bei anderen Substanzklassen geprüft und ist geeignet, die Empfindlichkeit von Aminen und Amiden besonders beim Einsatz von Acetonitril im positiven Elektrospraymodus zu steigern, ohne die chromatografischen Parameter zu ändern.

Literatur:

[1] Schmidt, C.K., Brauch, H.J. (2008) Environmental Science and Technology 42 (17) 6340-6346.

[2] Weber, W., Seitz, W., Schulz, W., Wagener, H.-A. (2007) Vom Wasser 105: 7–14.

[3] Brodacz, W., (2012) http://www.labo.de/spektroskopie/Matrixeffekte-in-der-LC-MS-462965.htm.

[4] Kowal, S., Balsaa, P., Werres, F., Schmidt, T.C. (2012) Analytical Bioanalytical Chemistry 403 (6) 1707-1717.

* Dr. S. Kowal, Dr. P. Balsaa, Dr. F. Werres, Prof. Dr. T. C. Schmidt : IWW Rheinisch-Westfälisches Institut für Wasser, 45476 Mülheim an der Ruhr

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