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Bessere Bilder durch neuen Detektor Laser-Scanning-Mikroskopie – Keine Kompromisse nötig

Autor / Redakteur: Joseph Huff* und Annette Bergter** / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Ein neues Beleuchtungs- und Detektionskonzept für Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM) bietet im Vergleich zum herkömmlichen LSM-Imaging sowohl eine höhere Auflösung als auch ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis (SRV) in Kombination mit gesteigerten Aufnahmegeschwindigkeiten. Lesen Sie, wie dies technisch realisiert wird.

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Abb.3: Anwendungsbeispiel für eine Resonanzscanning-Zeitserie im Vergleich zur Zeitserie mit Airyscan-Fast-Aufnahmemodus, bei dem Kardiomyozyten mit Tubulin-EMTB verwendet werden, um die Deformierung von Mikrotubuli bei hohen Bildraten zu messen. (Bilder oben) Standbilder aus einer Resonanzscanning-Zeitserie, die mit 80 Bildern/Sekunde erfasst wurde. (Bilder unten) Standbilder aus einer Zeitserie im Airyscan Fast-Modus, die mit 96 Bildern/Sekunde aufgenommen wurden. Jede Zeitserie zeigt jeweils die ruhenden Tubuli, kontrahierte Tubuli und wieder ruhende Tubuli.
Abb.3: Anwendungsbeispiel für eine Resonanzscanning-Zeitserie im Vergleich zur Zeitserie mit Airyscan-Fast-Aufnahmemodus, bei dem Kardiomyozyten mit Tubulin-EMTB verwendet werden, um die Deformierung von Mikrotubuli bei hohen Bildraten zu messen. (Bilder oben) Standbilder aus einer Resonanzscanning-Zeitserie, die mit 80 Bildern/Sekunde erfasst wurde. (Bilder unten) Standbilder aus einer Zeitserie im Airyscan Fast-Modus, die mit 96 Bildern/Sekunde aufgenommen wurden. Jede Zeitserie zeigt jeweils die ruhenden Tubuli, kontrahierte Tubuli und wieder ruhende Tubuli.
(Bild: Ben Prosser, University of Pennsylvania [3])

Das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop (LSM) hat sich in der biomedizinischen Forschung zu einem der beliebtesten Instrumente für Fluoreszenzabbildungs-Aufgaben entwickelt. LSM erfreut sich hauptsächlich deshalb so großer Beliebtheit, weil Forscher kontrastreiche Bilder und vielseitig optische Schnitte erstellen und so dreidimensionale biologische Strukturen [1] untersuchen können. Die Erstellung von optischen Schnitten durch das LSM erfolgt, indem ein fokussierter Laserpunkt beugungsbegrenzt über eine Probe geführt und Punkt für Punkt ein Bild erzeugt wird. Normalerweise wird das für jeden Punkt erzeugte Fluoreszenzlicht erfasst und durch eine Öffnung (Pinhole) auf einen nicht ortsauflösenden Detektor (typischerweise einen PMT-Detektor) zurückfokussiert. Beim traditionellen Detektionskonzept unterdrückt das Pinhole nicht fokussiertes Licht, der PMT-Detektor wandelt das verbleibende Licht aus der Fokusebene in ein digitales Signal um und erzeugt das Bild eines optischen Schnittes [2].

Das Video zeigt die Aufnahme eines Drosophila-Melanogaster-Embryos mit dem LSM 880

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Bei Konfokalsystemen konzentrierten sich in den letzten 25 Jahren die wichtigsten Entwicklungen von handelsüblichen Systemen auf neuartige Methoden, die den Bildkontrast, die Vielseitigkeit des Instruments und die Aufnahmegeschwindigkeit verbesserten. Heutige LSMs verfügen über die Flexibilität, die für viele Anwendungsbereiche in der Forschung notwendig ist. Sie liefern Daten zur Zelldifferenzierung, Cell tracking (Zellverfolgung) und dynamische Prozesse lebender Zellen, zur Expression und Lokalisierung von Proteinen, zu neuralen Netzwerkverbindungen, zur Gewebestruktur, Genexpression und Protein-/Genfunktion (um nur einige zu nennen). Trotzdem mussten Forscher bis zur Einführung des Airyscan-Detektionskonzepts beim LSM-System innerhalb der Leistungsmerkmale immer wieder Abstriche machen (d.h. entweder höhere Geschwindigkeit oder höhere Auflösung, höhere Auflösung oder besseres Signal-Rausch-Verhältnis usw.), um Anwendungsanforderungen erfüllen zu können. Mit der Einführung des Airyscan-Detektionskonzepts im Jahr 2014 und dem neuen Airyscan-Fast-Modus gehören diese Kompromisse des herkömmlichen Imaging der Vergangenheit an, da jetzt alle Messfunktionen simultan verbessert werden können.

Höhere Auflösung und besseres Signal-Rausch-Verhältnis

Das Airyscan-Detektordesign verbessert gleichzeitig das SRV und die Auflösung mithilfe eines hexagonal angeordneten GaAsP-PMT-Arrays mit 32 Kanälen, das in der Pinhole-Ebene liegt (s. Abb. 1) und das herkömmliche Pinhole-PMT-Konzept ersetzt. Dieses Konzept kombiniert zwei bevorzugte, aber einander widersprüchliche Einstellungen des Pinhole im herkömmlichen LSM: Ein offenes Pinhole lässt viel Licht passieren und erhöht dadurch das Signal-Rausch-Verhältnis; eine kleine Pinhole-Öffnung verbessert aber die Auflösung des Systems. Dabei verhält sich jedes der 32 Detektorelemente wie ein kleines unabhängiges Pinhole, bei dem nicht nur die optische Auflösung verbessert, sondern auch die räumliche Verteilung des Lichts erfasst wird.

Für den Einsatz von Airyscan für Bildaufnahmen mit Superauflösung kann die Zoomoptik so eingestellt werden, dass 1,25 Airy-Einheiten auf den Detektor projiziert werden; wobei jedes Detektorelement 0,2 Airy-Einheiten (Airy Units=AU) abdeckt und eine Verbesserung der optischen Auflösung um das 1,4-fache bewirkt. Zudem werden bis zu 50% mehr Licht erfasst als bei einem herkömmlichen LSM-System mit einem Pinhole, das auf 1 AU geöffnet ist. Durch die Anwendung einer linearen Dekonvolution wird eine Verbesserung der Auflösung um das 1,7-fache in allen drei räumlichen Dimensionen erreicht. Die gesteigerte Effizienz des Detektors Licht zu erfassen, verbessert das SRV um das 4- bis 8-fache und ermöglicht Forschern, biologische Prozesse wie die Wölbung von Mikrotubuli als Maßstab für die mechanische Belastung einer Zelle besser zu quantifizieren und zu untersuchen. (s. Abb. 2), [3].

Geschwindigkeit in konfokalen Punktscannern verbessert

Bisher wurde zur Steigerung der Aufnahmegeschwindigkeit bei konfokalen Punktscannern die Geschwindigkeit, mit der ein Laserpunkt das Sehfeld abrastert gesteigert, und so die Pixelverweildauer des Laserpunkts verkürzt. Für maximale Geschwindigkeiten werden Resonanzscanner in LSM-Systemen genutzt, die für ein vollständiges Sehfeld Bildraten von ca. 30 Hz ermöglichen. Wenn Forscher jedoch diese hohen Aufnahmegeschwindigkeiten verwenden möchten, müssen sie beim SRV eines Bilds Kompromisse eingehen. Der Grund dafür ist, dass der Laserpunkt bei erhöhter Erfassungsgeschwindigkeit kürzer auf einem Pixel verweilt und dadurch weniger Photonen verfügbar sind, wodurch sich das SRV beim Bild verschlechtert (s. Abb. 3, obere Bilder). Das SRV kann sich dabei so weit verschlechtern, dass eine Unterscheidung von einzelnen Merkmalen der Probe unmöglich wird und strukturelle Informationen beim Versuch, die notwendige zeitliche Auflösung zu erreichen, verloren gehen, wodurch die Methode unbrauchbar für das wissenschaftliche Ziel wird. Der neue Aufnahmemodus nutzt das innovative Konzept einer parallelen Anregung und Detektion, um Bildraten zu steigern ohne dabei das SRV zu opfern. Infolgedessen ist im neuen Fast-Modus der Anregungsstrahl so geformt, dass er vier Linien parallel beleuchtet und der Airyscan-Flächendetektor Daten von allen vier Linien gleichzeitig erfasst (s. Abb. 4). Durch Verwendung des Parallelansatzes wird die Erfassungsgeschwindigkeit um das 4-fache erhöht.

Durch die Parallelisierung werden die Aufnahmegeschwindigkeiten um einen Faktor von 4 erhöht, während eine lange Pixelverweildauer beibehalten werden kann, wodurch ein hohes SRV gegeben ist. Mit der deutlichen Erhöhung der Imaging-Geschwindigkeit kann gleichzeitig ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis beibehalten und aussagekräftige Daten gewonnen werden. Außerdem bleiben, zumal der Fast-Modus-Ansatz auf dem Airyscan-Detektor basiert, SRV und Auflösung auf einem hohen Niveau. Der Airyscan-Detektor im Fast-Modus gibt Forschern ab sofort die einzigartige Möglichkeit, gleichzeitig die Auflösung um das 1,5-fache und das SRV um das 4-fache zu steigern – und das bei einer viermal schnelleren Aufnahmegeschwindigkeit (s. Abb. 3, untere Bilder).

Informationsgewinn durch neuen Detektor

Das Airyscan-Detektionsmodul verzichtet auf das klassische physische Pinhole und den nicht ortsauflösenden Detektor und nutzt stattdessen eine Detektionseinheit in der Pinhole-Ebene, die auf einem neuartigen GaAsP-PMT-Flächendetektor mit 32 Kanälen basiert. Im Jahr 2014 wurde Airyscan als flexible und robuste Methode eingeführt, um die Auflösung und das SRV im Vergleich zum herkömmlichen konfokalen LSM deutlich zu erhöhen. Der Fast-Modus, der auf innovative Weise das Design und Prinzip des Airyscan-Detektors zunutze macht, bietet eine deutliche Steigerung der Aufnahmegeschwindigkeit, eine höhere Auflösung und ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis als ein herkömmliches konfokales LSM.

Literatur

[1] Conchello, J.-A. und J. W. Lichtman, Optical sectioning microscopy (Mikroskopie mit Erstellung optischer Schnitte). Nature Methods, 2005. 2(12): S. 920–931.

[2] Neu, T.R. und J.R. Lawrence, Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilmsat different scales (Innovative Techniken, Sensoren und Ansätze für das Imaging von Biofilmen auf verschiedenen Ebenen). Trends in Microbiology, 2015.

[3] Robison et Al, „Detyrosinated microtubules buckle and bear load in contracting cardiomyocytes“ (Deformierung und Belastung von detyrosinierten Mikrotubuli in kontrahierenden Kardiomyozyten), Science April 2016

[5] Sheppard, C.J., Super-resolution in confocal imaging (Superauflösung im konfokalen Imaging). Optik, 1988. 80(2): S. 53–54.

[6] Sheppard, C.J., S.B. Mehta und R. Heintzmann, Superresolution by image scanning microscopy using pixel reassignment (Superauflösung in der Image-Scanning-Mikroskopie mit Pixel-Neuzuweisung). Opt Lett, 2013. 38(15): S. 2889–2892.

[7] Huff, J., The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution (Der Airyscan Detektor von ZEISS: konfokales Imaging mit verbessertem Signal-Rausch-Verhältnis und Superauflösung). Nature Methods, 2015. 12.

[8] Weisshart, K., The basic principle of Airyscanning (Das Grundprinzip von Airyscanning). 2014. ZEISS Technologiebeschreibung

[9] Huff, J.; Bathe, W.; Netz, R.; Anhut, T.; Weisshart, K., The Airyscan detector from ZEISS. Confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and superresolution (Der Airyscan Detektor von ZEISS: konfokales Imaging mit verbessertem Signal-Rausch-Verhältnis und Superauflösung). 2015. ZEISS Technologiebeschreibung.

* J. Huff: Carl Zeiss Microscopy, LLC, Thornwood, USA

* *Dr. Annette Bergter: Carl Zeiss Microscopy GmbH

* Hinweis: Grundlage dieses Artikels ist eine englische Applikationsschrift.

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