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Hochdurchsatz-Screenings in den Biowissenschaften Lasershow für die Einzelzellanalytik – präzise gefertige Glasarrays

Autor / Redakteur: Cordula Krause-Widjaja* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Was früher ganze Labortische belegt hätte, passt heute auf eine handgroße Glasplatte: Tausende mikroskopisch kleine „Reaktionsgefäße“ lassen sich mit einem neuen Laserverfahren auf einen Wafer schreiben. Besonders für die Einzelzellanalyse ist diese Technik von großem Vorteil.

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Abb.1: Die Arralyze Workstation wurde für das Hochdurchsatz-Screening von Einzelzellen entwickelt. Sie nutzt spezielle, mit einem neuartigen Laserverfahren aus Glaswafern gefertigte Arrays für die Proben.
Abb.1: Die Arralyze Workstation wurde für das Hochdurchsatz-Screening von Einzelzellen entwickelt. Sie nutzt spezielle, mit einem neuartigen Laserverfahren aus Glaswafern gefertigte Arrays für die Proben.
(Bild: LPKF Laser & Electronics AG)

Miniaturisierung ist nicht nur in der Computertechnologie ein anhaltender Trend. Auch bei der Zellbiologie und anderen Bereichen hat sich in den vergangenen Jahrzehnten einiges getan. So ist der Begriff „Lab-on-a -Chip“ längst zu einem Standard geworden. Statt Proben in einzelnen Gefäßen zu untersuchen, wird heutzutage vermehrt mit Kleinstansätzen in Mikrofluidik-Systemen gearbeitet, was sich v. a. für die Analyse von einzelnen Zellen eignet.

Als Grundbausteine des Lebens kommt Zellen eine besondere Bedeutung zu, weshalb die Zellanalyse ein entscheidender Punkt ist, um die Vorgänge in lebenden Organismen zu beurteilen. Das Potenzial der Analyse und Manipulation auf Einzelzellebene für biomedizinische Anwendungen wird jedoch erst jetzt in großem Umfang erschlossen. Ein entscheidender Vorteil von Experimenten an einzelnen, individuellen Zellen ist, dass Einzelereignisse sichtbar gemacht werden, die bei der Anwendung von Bulkverfahren in der Masse untergehen. Mit der Einzelzellanalyse lassen sich Medikamente effizienter entwickeln, Therapien schwerwiegender Krankheiten effektiver designen sowie die moderne Biotechnologie optimieren, welche Zellen als „Fabriken“ nutzt.

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Gerade die derzeitige Pandemiesituation verdeutlicht, wie wichtig schnelle und quantitativ umfangreiche (diagnostische) Untersuchungen von Bio-Material sind – jenseits der reinen Forschungsarbeit. Für das Vereinzeln und Analysieren von Zellen, DNA und anderen biologischen Materialien, insbesondere für Hochdurchsatz-Experimente, werden meist Gefäße aus Kunststoff und zunehmend auch mikrofluidische Ansätze genutzt, um einige hundert bis mehrere Millionen Experimente durchzuführen. Aufgrund hoher Kosten der Reagenzien und der oft geringen Menge an verfügbarem biologischem Material, arbeitet man bevorzugt mit kleinen Volumina der einzelnen Reaktionsgefäße.

Wenn der Tropfen selbst zum Gefäß wird

Wegen des hohen möglichen Parallelisierungsgrades hat die so genannte Droplet-Technologie in den vergangenen Jahren enormen Vorschub bei der Untersuchung von biologischen Materialien für Hochdurchsatz-Screenings erfahren. Bei der Droplet-Technologie handelt es sich um ein mikrofluidisches Verfahren, bei dem man statt Glas- und Plastik-Vials kleine Tröpfchen als Reaktionsgefäße verwendet: Die zu untersuchende Probe ist dabei in einem wässrigen Tropfen in einer Ölphase eingeschlossen.

Dieses Verfahren bringt unter Umständen jedoch Nachteile mit sich, beispielsweise mögliche unerwünschte Diffusionsprozesse zwischen einzelnen Tröpfchen und der Ölphase. Ein weiterer Nachteil ist die allgemein schlechte Übertragbarkeit auf in-vivo-Bedingungen. Aus Mangel an Alternativen werden diese Nachteile bei vielen Experimenten jedoch in Kauf genommen. Eine weitere Hürde dieser Methode waren lange Zeit qualitative Limitierungen bei der Herstellung von Kleinststrukturen in Kunststoff oder Glas. Die Mikrostrukturen ließen sich nicht in der nötigen Präzision herstellen. Dabei ist Glas ein besonders vorteilhaftes Material im Kontext der Zellanalytik, da es sich biologischen Proben gegenüber inert verhält und durch seine optische Transparenz vielseitige mikroskopische Untersuchungen zulässt. Kreuzkontaminationen lassen sich bei der Nutzung von Glas vermeiden, interkompartimentelle Diffusion von Reagenzien und Medikamenten vollständig unterdrücken.

Glasarrays auf neuem Präzisionslevel

Hier setzt eine neu entwickelte Plattform von Arralyze an, die Einzelzellexperimente mittels extremer Miniaturisierung und hohem Parallelisierungsgrad kostengünstig ermöglicht. Dazu nutzt der Hersteller LPKF die eigens entwickelte Methode des Laser Induced Deep Etching, Kurze LIDE. Diese Technik ist sozusagen der Fine Liner unter den Laser-Schreibwerkzeugen. Damit lassen sich in Standardglas tausende bis zu Millionen defektfreie Kleinststrukturen auf kleinster Fläche in herausragender Qualität und mit hohen Aspektverhältnissen realisieren. Diese Arrays oder Biochips haben Ausnehmungen mit Durchmessern von 5 µm bis in den Millimeterbereich und erlauben es, Experimente mit Volumina vom Piko- oder Nanoliter- bis in den Mikroliterbereich durchzuführen.

Die Arrays lassen sich jeweils spezifisch an den Zelltyp und die Anforderungen des Assays anpassen. Auch einzelne Zellen und Zellcluster in verschiedenen Anordnungen bis hin zur Gewebeebene lassen sich so untersuchen – und das alles auf demselben Array. Die Bedingungen, denen die Zellen, Cluster und Gewebe ausgesetzt sind, sind daher gleich; Merkmale, die durch den Organisationsgrad der Zellen bedingt sind, lassen sich unterscheiden.

Umfassender Blick auf die lebende Zelle

Unter der Marke Arralyze werden die Glasarrays zusammen mit einer Workstation angeboten, die nativ mit den Arrays umgehen kann. Sie ist mit Präzisionswerkzeugen ausgestattet, um die Möglichkeiten der Glasarrays vollständig auszunutzen. Dies umfasst z. B. die präzisen Druckköpfe, um Biomaterial, Reagenzien und auch lebende Zellen gezielt in die Ausnehmungen zu drucken. Über ein Mikroskop lässt sich der Fortgang der Experimente in der Workstation live dokumentieren. Hochgenaue Werkzeuge zum Extrahieren der Zellen ermöglichen es, besonders interessante oder leistungsfähige Zellen im Anschluss an ein Screening lebend zu isolieren und mit ihnen weiterzuarbeiten.

Die Arralyze-Workstation ist ausgestattet mit Druckköpfen, Kapillaren und optischen Inspektionskomponenten. Weil sich die Glas-Arrays individuell fertigen lassen, eignet sich das System für zahlreiche verschiedene Anwendungen. Mit kleinsten Features, weitgehender Designfreiheit der Arrays und exaktem Handling wird die Arralyze Workstation zu einem wertvollen Werkzeug in vielen Life Science Laboren, was die Forschung in diesen Laboren unterstützt.

Per Laserstrahl zur Mikrostruktur

Der Ansatz dieses Verfahrens stellt in Aussicht, die Forschung und Entwicklung im Bereich Zellbiologie maßgeblich voranzubringen. Als Basis für eine Vielzahl von Anwendungen in der Mikrosystemtechnik nutzt LPKF die eigens entwickelte LIDE-Technologie. Das maskenlose, direkt strukturierende Laserverfahren erzeugt im ersten Prozessschritt kleinste Modifikationen in der Struktur jeder Art von dünnem Glassubstrat. Mit einzelnen Laserpulsen werden also Modifikationen über die gesamte Glasdicke durchgeführt. Es können tiefe Strukturen wie Durchgangslöcher oder Mikroschnitte sowie präzise designte Vertiefungen realisiert werden. Das Glas wird mit den Modifikationen im anschließenden zunächst Nassätzprozess anisotropisch geätzt, d. h. der Materialabtrag erfolgt nur in einer Richtung (s. Ergänzendes zum Thema). Das Ergebnis sind exakt geformte Features mit hohen Aspektverhältnissen im Glas – die Tiefe der Strukturen ist also deutlich größer als die Breite bzw. horizontale Ausdehnung.

Ergänzendes zum Thema
Anisotropes Ätzen

In Glas lässt sich, wie in andere Materialien auch, durch ein chemisches Nass-Ätz-Verfahren eine Struktur in die Oberfläche bringen. Dabei löst das Ätzmittel Material auf und die entstehende Vertiefung verläuft von diesem Punkt der Oberfläche aus in jeder Richtung mit der gleichen Geschwindigkeit, also isotrop. Daher sind klassisch nur flache Strukturen mit einem Aspektverhältnis von <1 möglich. Durch vorhergehende Laserbehandlung lässt sich jedoch auch anisotropes Ätzen mit einem Aspektverhältnis von bis zu 1:50 verwirklichen: Die mittels Laser modifizierten Bereiche des Glases werden wesentlich schneller abgetragen als das nicht-modifizierte Material.

Bislang erforderte die Bearbeitung von Dünnglas-Substraten komplizierte und oft kostspielige Verfahren, die darüber hinaus üblicherweise Mikrorisse und Spannungen im Glas erzeugten. Bei den herkömmlichen Verfahren gingen bestimmte Eigenschaften des Substrates verloren, Qualität und Produktionsausbeute waren geringer und im späteren Betrieb war mit einer reduzierten Zuverlässigkeit zu rechnen. Diese aus dem Bearbeitungsprozess entstehenden Nachteile haben Glas den Ruf eingetragen, ein Material mit ungünstigen mechanischen Eigenschaften zu sein: schwer zu bearbeiten und durch die erheblichen Verluste im Produktionsprozess letztendlich für viele Anwendungen teuer. Das von Arralyze genutzte Verfahren überwindet diese Probleme weitgehend. Im Einsatz mit dem Arralyze-System kann Glas nun für Hochdurchsatz-Screenings genutzt werden, die schnell und mit geringstem Materialaufwand exakte Ergebnisse in den Life-Science-Laboren hervorbringen.

* C. Krause-Widjaja, LPKF Laser & Electronics AG, 30827 Garbsen

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