GC-MS Legalisierung von Cannabis: Qualitätskontrolle per Metabolomics

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Redaktionsbüro Guido Deußing

Cannabis gehört zu den wohl ältesten Heil- und Nutzpflanze der Menschheit. In immer Ländern sind oder werden Cannabis-Produkte für medizinische Anwendungen legalisiert. Voraussetzung für eine kommerzielle Nutzung ist jedoch eine umfangreichen Bestimmung der Hanf-Inhaltsstoffe. Die Stir-Bar-Sorptive-Extraction (SBSE) mit 2D-Thermodesorptions-GC-TOF-MS lässt einen dezidierten Blick in den pflanzlichen Stoffwechsel zu.

Cannabis, eine den Hanfgewächsen zugehörende Pflanzengattung, ist das wohl älteste bekannte Nutz- und Heilkraut, das neuesten gesicherten Erkenntnissen zufolge erstmals in der frühen Jungsteinzeit in Ostasien domestiziert wurde [1]. Von China aus trat es über Indien und die frühen Hochkulturen Vorderasiens seinen Weg um den Globus an. Die Verbreitung erfolgte nicht allein der Gewinnung von Pflanzenfasern wegen, aus Hanf lassen sich Taue, Seile, Netze, Bindfäden und Zwirn herstellen [2]: Historische Quellen aus Indien aus der Zeit um 2000 Jahren vor Christi Geburt weisen darauf hin, dass Cannabis vornehmlich für den Drogenkonsum angebaut worden sei.

Diese Form des Cannabis breitete sich in den verschiedensten Regionen der Welt aus, etwa nach Afrika im 13. Jahrhundert und Lateinamerika im 16. Jahrhundert. Im 20. Jahrhundert erreichte es vom indischen Subkontinent kommend Nordamerika [1]. Neben seiner berauschenden Wirkung, die insbesondere dem Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC) zugeschrieben wird, wusste man schon früh das gesundheitsfördernde Potenzial von Cannabis zu nutzen. In China etwa wurde es zur Behandlung einer Vielzahl von Leiden eingesetzt, angefangen bei Verstopfung, über Gicht, Malaria, Rheuma bis hin zu Fieber, Appetitlosigkeit, phlegmatischen Zuständen und Sprechschwierigkeiten [3].

Pharmakologisches Potenzial von Cannabis

Heute gilt das pharmakologische Potenzial von Cannabis – man unterscheidet im Wesentlichen zwei Arten, namentlich Cannabis sativa und Cannabis indica [4] – als gesichert. Nachweislich ist dessen therapeutische Wirkung auf verschiedene Krankheiten, die von chronischen Schmerzen und Multipler Sklerose (MS) bis hin zu Epilepsie und Angstzuständen reichen [5].

Was aber macht Hanf zu einem derart nützlichen Pharmakon? Weit entfernt von der anfänglichen vereinfachten Betrachtung, dass nur Δ9-THC die biologische Aktivität des Cannabis trage, schreiben Flavio A. Franchina, Lea M. Dubois und Jean-François Focant aus der Molecular Systems, Organic and Biological Analytical Chemistry Group der Universität Liège (Lüttich) in Belgien, dass zahlreiche Studien die Bedeutung und das Zusammenwirken der verschiedenen in Cannabis vorliegenden Metaboliten aufgezeigt und zur Isolierung neuer aktiver Verbindungen geführt hätten [6]. Cannabis enthalte – je nach Art – mehr oder weniger Δ9-THC sowie andere endogene Metaboliten, Cannabidiol (CBD) etwa, ebenfalls ein Cannabinoid; CBD wird u. a. eine entkrampfende, entzündungshemmende, schmerzstillende, angstlösende und beruhigende Wirkungen zugeschrieben [7].

Wenngleich einzelne Cannabis-Metaboliten einen stärkeren Effekt zeigten als andere, sei das Gleichgewicht und Zusammenwirken aller Metabolite für die Wirkung der Hanfpflanze,bedeutend, schreiben Franchina, Dubois und Focant. Das betreffe nicht allein die medizinische Anwendung, sondern auch die Verwendung von Cannabis in Lebensmitteln oder Kosmetika. Cannabis kommerziell erfolgreich vermarkten zu wollen, verlange daher nach einer dezidierten Kenntnis dessen chemischer Zusammensetzung. Sich ein Bild zu machen, von den in Cannabis enthaltenen primären und sekundären Metaboliten, hatten sich die Forschenden auf die Fahne geschrieben [6].

Die Zusammensetzung der pflanzlichen Inhaltsstoffe erforschen

„Die Phytochemie von Cannabis ist komplex“, schildern Franchina, Dubois und Focant. Bislang habe man mehr als 530 verschiedene und chemisch unterschiedliche, dem primären und sekundären Stoffwechsel der Hanfpflanze entstammende Verbindungen identifiziert, darunter etwa 110 Cannabinoide und 140 Terpenoide. Letztgenannte seien laut den Forschenden von besonderem Interesse, und zwar ihrer organoleptischen Eigenschaften wegen sowie ihres Potenzials für den chemischen Fingerabdruck verschiedener Sorten und ihrer synergetischen Wechselwirkung mit den Cannabinoiden [6].

Allerdings erweise sich die Erforschung der Zusammensetzung der pflanzlichen Inhaltsstoffe als Herausforderung. Klassische Ansätze zur Charakterisierung seien jedenfalls wenig geeignet, die komplexe chemische Vielfalt und Heterogenität der verschiedenen Cannabisarten und -produkte vollständig zu erfassen. Forschung tut daher Not, wie auch Cannabis-Experten der United States Pharmacopeia (USP) andeuten: „Angesichts der erlaubten Verwendung von Cannabis für medizinische Zwecke in einer Mehrheit der US-Bundesstaaten und in vielen Ländern auf der ganzen Welt, der bekannten und nachgewiesenen Qualitätsprobleme mit Cannabis und der aktiven laufenden klinischen Forschung in diesem Bereich werden Angehörige der Gesundheitsberufe, die Forschungsgemeinschaft und vielleicht am wichtigsten Patienten und die Öffentlichkeit von einer verstärkten Qualitätskontrolle von Cannabis profitieren. Informationen über die Qualitätsmerkmale von Materialien in Bezug auf Identität, Zusammensetzung und Reinheit sowie die wissenschaftlichen Ressourcen, um diese zu testen, können dazu beitragen, Patientenschäden zu vermeiden, die sich aus der Exposition gegenüber minderwertigen, kontaminierten oder verfälschten Cannabisprodukten ergeben. Darüber hinaus wird die Verfügbarkeit von Cannabis oder seiner Bestandteile, die gemäß vereinheitlichter Herstellungspraktiken erzeugt werden, die Repro­duzierbarkeit und Anwendbarkeit präklinischer und klinischer Daten erhöhen.“ [8]

Blick auf analytische Details

Mit Blick auf die USP formulieren Franchina, Dubois und Focant die Bedeutung der Probenahme und analytischer Tests zur Bestimmung von Identität, Gehalt und Grenzwerten potenzieller Inhaltsstoffe. Um die in Cannabis enthaltenen Metaboliten umfangreich erfassen, charakterisieren und quantifizieren zu können, wählten die Forscher die 2D-Gaschromatographie mit anschließender hochauflösender Flugzeit-Massenspektrometrie (GCxGC-HRT-TOF-MS; Agilent 7890 GC; Leco Pegasus 4D). Als Proben für die Methodenentwicklung verwendeten sie Cannabisblüten (acht Proben), die sie nach eigenen Angaben in einem örtlichen CBD-Laden in Lüttich käuflich erworben hatten. Die Proben wurden homogenisiert und in luftdicht verschlossenen Probengefäßen aufbewahrt. Als Qualitätskontrollprobe wurden die trockenen Blätter eines Hanftees verwendet und dem gleichen Analysenprozedere unterzogen.

Ein besonderes Augenmerk richteten die Forschenden auf die Probenahme bzw. die Extraktions- und Anreicherungsbedingungen. Sie wählten die Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE) mit dem PDMS-Twister (Gerstel) als Extraktionsmedium, nicht zuletzt aufgrund dessen besonderer Eignung für den Nachweis von in Spuren vorliegender organischer Verbindungen wie auch seiner hohen Anreicherungskapazität wegen, wie Franchina, Dubois und Focant schreiben. Zudem hat sich die SBSE bereits in der Metabolomik bewährt [9]. Die Forschenden optimierten die SBSE, so „dass eine breite Selektivität für mehrere Klassen von Metaboliten (Terpene, Cannabinoide, Kohlenwasserstoffe sowie terpenoide Alkohole und Fettsäuren) erreicht wurde“ [Probe in einem Gemisch aus Wasser, Methanol und Aceton (5:4:1); Extraktionsdauer: 60 min; Extraktionstemperatur: 50 °C]; Chlorbenzol wurde als interner Standard (IS) eingesetzt.

Die Analyten wurden nach der Extraktion in einer Thermal-Desorption-Unit [Gerstel-TDU, 30 °C – 11,6 °C/s – 30 °C (5 min)] temperaturprogrammiert auf das Kalt-Aufgabe-System [Gerstel-KAS; 20 °C – 12 °C/s – 300 °C (5 min)] des GC überführt (Agilent 7890; Trennsäule GC 1: Rxi-5MS [5 °C ( min) – 3 °C/min –330 °C (2 min)]; GC 2: Rxi-17Sil MS [50 °C (2 min) – 3 °C/min – 330 °C (2 min)]; beide Säulen von Restek Corporation) fokussiert und von dort im Split-Modus im Heliumstrom auf das Trennsystem überführt. Die Probenaufgabe erfolgte automatisiert (Gerstel-Multi-Purpose-Sampler, MPS). Detektiert wurde in einem Massenbereich von 40 bis 400 m/z, wobei 150 Spektren pro Sekunde erfasst wurden, berichten Franchina, Dubois und Focant. Die Ionisierung erfolgte durch Elektronenbeschuss; die Temperatur der Ionenquelle betrug 230 °C. Für die Peakerkennung wurde ein Signal/Rauschverhältnis (S/N) von 50 definiert. Die Identifizierung der Signale erfolgte mittels Vorwärtssuche in der NIST-Datenbank (2017) sowie unter Verwendung von Retentionsindizes.

Wirksame Profilierung

Fassen wir zusammen: Franchina, Dubois und Focant haben eine Methodik zur Bestimmung pflanzlicher Metaboliten entwickelt mit dem Ziel einer Entschlüsselung der komplexen Phytochemie von Cannabis. Die Forschenden extrahierten dazu die Cannabisblütenstände und nutzten die SBSE zur Anreicherung der Metaboliten. Die Analyten wurden thermisch in ein 2D-Gaschromatographie-System (GC × GC) desorbiert, mittels niedrigauflösender Massenspektrometrie (MS) gescreent und anschließend mittels hochauflösender MS zweifelsfrei identifiziert und quantifiziert. Besondere Aufmerksamkeit wurde der Optimierung der Extraktionsbedingungen gewidmet, um die Abdeckung der Analyten zu erweitern, und der chromatographischen Trennung, um einen robusten Datensatz für die Erstellung von Profilen der analysierten Cannabis-Arten zu erhalten. Monoterpene, Sesquiterpene, Kohlenwasserstoffe, Cannabinoide, andere Terpenoide und Fettsäuren wurden bei der Optimierung der Extraktionsbedingungen berücksichtigt.

Die Reaktion ausgewählter Ionen für jede chemische Klasse, die in spezifischen 2D-chromatografischen Regionen abgegrenzt wurden, ermöglichte eine genaue und schnelle Bewertung relevanter Extraktionsvariablen, die so gewählt wurden, dass sie eine breite Auswahl an Analyten sowie eine gute Reproduzierbarkeit gewährleisteten. Unter optimierten SBSE-Bedingungen wurden schließlich acht verschiedene Cannabisblütenstände und eine Qualitätskontrollprobe analysiert. Die 754 Hauptkomponenten unter den bestimmten Metaboliten wurden dazu verwendet, die chemischen Unterschiede zwischen den Probentypen, die mit den Unterarten der Pflanze in Verbindung gebracht werden konnten, zu definieren.

Um die verschiedenen Extraktionsbedingungen und damit die Extraktionseffizienz zu bewerten, berücksichtigten die Forschenden in ihrer Methode die Signalintensität charakteristischer m/z-Ionen der jeweiligen chemischen Klasse. „Beispielsweise wurde der EIC, der aus der Summe der 231 + 295 + 299 m/z-Ionen gebildet wird und in der Klassifizierungsregion der Cannabinoide eluiert, für diese Klasse während der Extraktionsoptimierung verwendet“, schreiben Franchina, Dubois und Focant. Die Wiederfindung des IS, der Probe vor der SBSE-Extraktion zugesetzt, wurde individuell mittels des charakteristischen 117 m/z-Ions bewertet.

Für jede Klasse habe die Kombination der Elutionsklassifizierungsregion und des MS-Filters die Optimierung der Extraktionsbedingungen erleichtert, berichten die Forschenden, so dass eine genaue Signalauswertung über eine große Anzahl von Analyten (∼800) statt über einige wenige möglich gewesen sei und, wichtiger noch, Fehler in der Klassifizierung minimiert werden konnten.

Quantifizierung ist möglich

Mit der gleichen SBSE-GC × GC-MS-Methode wurde eine gezielte quantitative Analyse von drei gängigen Cannabinoiden durchgeführt, nämlich Δ9-Tetrahydrocannabinol, Cannabidiol und Cannabinol. Die Methode wurde validiert und ergab Korrelationsfaktoren von über 0,98 und eine Reproduzierbarkeit von <20 % (relative Standardabweichung).

Auch wenn ein gründliches Screen­ing exogener Verbindungen im Rahmen ihrer Forschungsarbeit nicht verfolgt worden sei: „Die hochauflösende MS-Erfassung ermöglichte eine zuverlässige Identifizierung endogener Verbindungen, in einigen der Proben auch die von Pestiziden und Weichmachern sowie die eines Cannabidiol-Abbauproduktes “, berichten die Forschenden. Ihre Methode zeige, schlussfolgern Franchina, Dubois und Focant, wie wichtig neuartige umfassende und hochauflösende Test- und Charakterisierungsmethoden für Cannabisprodukte seien. Ihre Studie stellt die erste Anwendung der Methode auf Cannabisblütenstände dar und soll auf andere verwandte Probentypen ausgeweitet werden. Schlussendlich komme mit der SBSE eine umweltfreundliche Probenvorbereitungstechnik zur Anwendung, die in Kombination mit einer durchflussmodulierten GC × GC-MS-Methode ohne Kryogene auskomme. Dies stelle einen effektiven und nachhaltigen Ansatz für die ungezielte Profilerstellung und gezielte Analyse komplexer Proben dar.

Literatur:

[1] Ren et al., Large-scale whole-genome resequencing unravels the domestication history of Cannabis sativa, Science Advances 7, 29 (2021), https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abg2286

[2] (Indischer) Hanf – Cannabis, Kooperation Phytopharmaka, Arzneimittellexikon, https://arzneipflanzenlexikon.info/cannabis.php, 16.11.2021

[3] Alexandra Latour, Die Geschichte von Cannabis als Medizin, Leafly 11.06.2018, https://www.leafly.de/die-geschichte-von-cannabis-als-medizin/

[4] Alexandra Latour, Cannabis Sorten: Indica, Sativa und Ruderalis – Das sind die Unterschiede, Leafly (2018), https://www.leafly.de/indica-sativa-ruderalis-cannabis-sorten/

[5] Arno Hazekamp, Katerina Tejkalová und Stelios Papadimitriou, Cannabis: From Cultivar to Chemovar II—A Metabolomics Approach to Cannabis Classification, Cannabis und Cannabinoid Research 1 (2016) 202-215, https://doi.org/10.1089/can.2016.0017

[6] Falvio A. Franchina, Lea M. Dubois und Jean-François Focant, In-Depth Cannabis Multiclass Metabolite Profiling Using Sorptive Extraction and Multidimensional Gas Chromatography with Lowand High-Resolution Mass Spectrometry, Analytical Chemistry 92 (2020) 10512-10520, https://dx.doi.org/10.1021/acs.analchem.0c01301

[7] Cannabidiol (CBD) Wirkung & Fakten, Krankenkassen Zentrale, https://www.krankenkassenzentrale.de/wiki/cbd

[8] Sarma et al., Cannabis Inflorescence for Medical Purposes: USP Considerations for Quality Attributes, Journal of Natural Products 83, 4 (2020) 1334-1351, https://doi.org/10.1021/acs.jnatprod.9b01200

[9] Guido Deußing, Der andere Spargelduft, Laborpraxis 5 (2020), https://www.laborpraxis.vogel.de/der-andere-spargelduft-a-936166/

* G. Deußing, Redaktionsbüro Guido Deußing, 41464 Neuss

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