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Mikrofluidik ermöglicht schnelle Analyse Legionellen in Rekordzeit quantifizieren

Autor / Redakteur: Hans-Anton Keserue*, Anna-Katharina Ehlert* & Daniel Schaffhauser* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Die Infektionsquelle schnell zu identifizieren, ist bei Ausbrüchen der Legionärskrankheit essenziell, um Maßnahmen zu ergreifen. Durch die Kombination von Mikrofluidik und Durchflusszytometrie können innerhalb von ein bis zwei Stunden präzise Ergebnisse erzielt werden.

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Die Separation der bakteriellen Zielzellen aus einer Probe erfolgt in einer mikrofluidischen Einwegkartusche mittels eines Magnetfelds.
Die Separation der bakteriellen Zielzellen aus einer Probe erfolgt in einer mikrofluidischen Einwegkartusche mittels eines Magnetfelds.
(Bild: rqmicro)

Legionellen-Bakterien wurden erst 1976 entdeckt und beschrieben. Damals fand ein Kongress der Amerikanischen Legion, ein Veteranenverein, statt, während dem zahlreiche Teilnehmer an einer mysteriösen Lungenentzündung erkrankten. Ärzte und Mikrobiologen identifizierten nach fieberhafter Suche ein Bakterium als Auslöser dieser „Legionärskrankheit“ und benannten es Legionella [1].

Im Gegensatz zu anderen Bakterien sind Legionellen vergleichsweise hitzeresistent und vermehren sich bevorzugt bei Temperaturen von 25 °C bis 45 °C. Durch die Etablierung von Warmwassersystemen, Raumklimaanlagen oder auch Whirlpools scheinen sie eine ökologische Nische gefunden zu haben, die sie zu einer ernsten Gesundheitsgefährdung macht. Die Infektion erfolgt über das Einatmen von Aerosolen. Diese entstehen in der Dusche oder in Klimaanlagen, aber auch beispielsweise Zierbrunnen wurden schon als Infektionsquelle identifiziert. Man schätzt, dass in Europa jährlich 10 000 Fälle der lebensbedrohlichen Legionärs­pneumonie auftreten. Die Letalitätsrate beträgt durchschnittlich 10% [2]. Ausbrüche sind besonders gravierend, wenn sie in Krankenhäusern, Altersheimen oder Hotels auftreten. Das Risiko besteht jedoch auch in gewöhnlichen Wohnhäusern. In den letzten Jahren ist in Deutschland eine Reihe von Fällen bekannt geworden, bei denen neuerrichtete Hausinstallationen mikrobiell kontaminiert waren und sich als schwer sanierbar erwiesen [3, 4].

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Jedes Jahr kommt es zu zahlreichen Ausbrüchen, verursacht durch Legionellen, die Klimaanlagen, Kühltürme oder Trinkwassersysteme besiedeln [5]. Der bisher größte Ausbruch von Legionellen in Deutschland ereignete sich 2013 in Warstein. Untersuchungen ergaben, dass eine Kläranlage im Belebtbecken eine hohe Legionellen-Kontamination aufwies und die Keime über einen Fluss zu industriellen Rückkühlanlagen gelangten. Von dort wurden die Legionellen über Aerosole in die Umwelt verteilt und es kam zu 165 Erkrankungen [6]. Problematisch ist, dass die Ausbruchsquelle, wenn überhaupt, oft erst nach rund zwei Wochen identifiziert werden kann, da die Analytik zeitaufwändig und fehleranfällig ist.

Das Standardverfahren hinterfragen

Die etablierte Standardmethode zur Legionellen-Detektion, ISO 11731 [7], basiert auf dem Plattierungsverfahren, das zu sehr variablen Ergebnissen führt und 10 bis 14 Tage dauert [8–10]. Ein ausgedehnter Ringversuch zwischen verschiedenen Laboratorien in den USA hat außerdem gezeigt, dass die Legionellen-Konzentration mit Plattierungsmethoden dramatisch unterschätzt werden kann [11]. Ein Grund dafür ist, dass ein Anteil der in einer Probe vorhanden bakteriellen Zellen zwar lebendig ist, auf dem Agarmedium aber nicht wächst [12] – und damit durch die Standardmethode nicht detektiert wird. Gerade nach Stagnation und chemischer oder thermischer Desinfektion kommen solche Zellen, genannt VBNC-Zellen (englisch für viable but non-culturable) vermehrt vor. Da die Effizienz von Hygienisierungsmaßnahmen mit der Standardmethode überprüft wird, sind die mikrobiologischen Resultate dann natürlich schwer interpretierbar [13, 14]. Es ist deshalb nicht verwunderlich, dass oft schon Wochen nach erfolgten Desinfektionsmaßnahmen wieder sehr hohe Legionellen-Kontaminationen gemessen werden [4, 15].

Bedenklich ist generell, dass die große Mehrheit der Informationen über die Verbreitung und das Verhalten von Krankheitserregern in Wassersystemen mit eben diesen konventionellen, kultivationsabhängigen Verfahren erarbeitet wurden. Dies bedeutet nach neuestem Wissensstand, dass die Genauigkeit und Verlässlichkeit der Daten weder zufriedenstellend, noch ausreichend für die Bewertung der Trinkwasserhygiene ist.

Die neue Methode – schneller und präziser

Die Schnelldetektion der Gesamtzahl an bakteriellen Zellen in einer Wasserprobe mittels Durchflusszytometrie etabliert sich in Wasserlaboren weltweit [16, 17]. Die Firma RQ Micro AG, ein Spin-Off der ETH Zürich, hat sich zum Ziel gesetzt, diese Methode für verschiedene Anwendungszwecke zu optimieren. Dank einer ausgeklügelten Probenaufbereitung, die das interdisziplinäre Team von RQ Micro entwickelt hat, gelingt es Legionellen aus Wasserproben in Rekordzeit zu isolieren, zu detektieren und zu quantifizieren.

Die Methode basiert auf der immunomagnetischen Isolation der Zellen mithilfe magnetischer Partikel und anschließender durchflusszytometrischer Detektion. Von der Probenahme bis zum Resultat vergehen dabei lediglich ein bis zwei Stunden. Im Gegensatz zu den etablierten Verfahren erfasst das Testverfahren von RQ Micro aber sämtliche potenziell infektiösen Legionellen – eben auch jene Zellen, die auf den Agarplatten nicht wachsen (VBNC-Zellen).

Die sprichwörtliche Nadel im Heuhaufen finden

Magnetische Partikel verbinden sich mithilfe eigens entwickelter Antikörper mit der Oberfläche der Legionellen. Durch ein Magnetfeld können sie dann aus der Masse der sich im Wasser befindlichen Begleitflora und Schmutzpartikel „herausgefischt“ werden. Weshalb dieser Schritt nötig ist wird schnell klar, wenn man sich vor Augen führt, dass ein Liter Trinkwasser rund 100 Mio. bakterielle Zellen enthält. Die Detektion von lediglich hundert vorhandenen Legionellen, was einer Konzentration von 0,0001 % entspricht, kommt der sprichwörtlichen Suche nach der Nadel im Heuhaufen gleich. Gleichzeitig zur immunomagnetischen Isolation sorgen die an Antikörper gebundenen, fluoreszenten Farbstoffe dafür, dass die Legionellen über Fluoreszenzemission mit einem Durchflusszytometer erkannt werden können.

Zusätzlich zu der genaueren Bewertung und der schnelleren Quantifizierung spricht für die durchflusszytometrische Detektion, dass sie den physiologischen Zustand von Zellen anzeigt. So können beispielsweise membrangeschädigte, und damit tote Zellen, von lebendigen Zellen unterschieden werden. Dies geschieht mit speziellen Farbstoffen, die nur in beschädigte, tote Zellen eindringen können. Durch die stärkere Färbung der toten Zellen, sind diese einfach zu identifizieren.

Die Möglichkeit, nicht nur die Präsenz, sondern auch die physiologischen Zustände von Zellen zu beurteilen, ist von besonders großem Nutzen bei Desinfektionsmaßnahmen. Damit ist die Basis geschaffen, um heutige Desinfektions- und Sanierungsmaßnahmen, die leider nicht immer zu einer nachhaltigen Problemlösung führen [4, 15] neu zu bewerten und verbesserte Verfahren anzubieten. Neue Testverfahren ermöglichen also auch die Optimierung der Sanitär- und Gebäudetechnik, beispielsweise durch verbesserte Rohrleitungssysteme oder Probeentnahmestellen an kritischen Stellen.

Automatisierung mithilfe der Mikrofluidik

Das entwickelte Cellstream-Gerät bedient sich zahlreicher Vorteile der Mikrofluidik, um die Zellseparation effizient und automatisch zu bewerkstelligen. Die Integration der Mikrofluidik in Kartuschen reduziert Anwendungsfehler dramatisch und senkt die Arbeitszeit deutlich. Dank der Parallelisierbarkeit der Mikrofluidik können in einer Kartusche mehrere Proben gleichzeitig verarbeitet werden.

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Da die Flüssigkeit in der Kartusche aufgrund der kleinen Kanaldimensionen laminar fließt, d.h. turbulentes Fließverhalten verhindert wird, ermöglicht das Verfahren eine sehr hohe Prozesskontrolle. Die Dosierung der Probe innerhalb der Kartusche lässt sich dadurch zeitlich und örtlich genau steuern, was in Kombination mit einem stark lokalisierten Magnetfeld innerhalb der Mikrofluidik im Vergleich zu herkömmlichen Methoden eine viel effizientere magnetische Aufreinigung erlaubt. Dies hat zur Folge, dass die mittels Mikrofluidik aufgereinigte Probe die störenden Hintergrundsignale weitestgehend eliminiert und diese somit während der Messung im Durchflusszytometer nicht mehr stören. Die manuelle Grenzwertbestimmung, im Fachjargon „gating“ genannt, wird somit an einem konventionellen Durchflusszytometer extrem vereinfacht.

Dank der Automatisierung der Zellseparation ist der Arbeitsablauf simpel. Nach Filtration einer Wasserprobe von bis zu einem Liter werden die Zellen von der Filteroberfläche abgelöst und in eine Pufferlösung aufgenommen. In dieses folglich sehr viel kleinere Volumen werden nun die Antikörper mit Fluorophoren und magnetischen Nanopartikeln hinzugegeben. Nach Abschluss der Inkubation werden die Proben in die mikrofluidische Kartusche pipettiert und vom Cellstream-Gerät vollautomatisch aufgereinigt. Die Flüssigkeit in der Kartusche wird mittels eines patentierten Mikroluftdruckverfahrens durch die mikrofluidischen Kanäle bewegt – die Flüssigkeit verweilt somit stets in der Kartusche. In Kombination mit dem Einweg-Gebrauch der Kartusche kann somit eine ungewollte Kreuzkontamination praktisch ausgeschlossen werden. Im Anschluss an die Aufreinigung in der Kartusche kann die Probe mit den gefärbten Zielorganismen in ein Durchflusszytometer überführt und die Zellzahl bestimmt werden. Der gesamte Ablauf ist in Abbildung 1 veranschaulicht.

Weitere Kits sind bereits in der Pipeline

Das Cellstream ist seit Mitte 2016 kommerziell mit einem Kit für Legionella pneumphila SG1 erhältlich. Noch in diesem Jahr werden Kits für L.p. SG 1-15 und L. spp. auf den Markt kommen. Weitere Kits zur Detektion von Pseudomonas aeruginosa, Salmonellen und E. coli sind in Entwicklung.

Eine weitere Anwendung der Cellstream-Separation ist die Verwendung der aufgereinigten Proben für die heutigen Kultivationsverfahren. Durch die Methode wird störende Begleitflora eliminiert, was eine sinnvolle Detektion von Legionellen in Oberflächengewässern, Abwässern und Kühltürmen ermöglicht. Studien dazu sind am Laufen und zeigen bereits vielversprechende Resultate.

Literatur

[1] D. J. Brenner, A. G. Steigerwalt, and J. E. McDade, “Classification of the Legionnaires’ disease bacterium: Legionella pneumophila, genus novum, species nova, of the family Legionellaceae, familia nova,” Ann. Intern. Med., vol. 90, no. 4, pp. 656–658, Apr. 1979.

[2] ECDC, “Legionnaires’ disease in Europe, 2010,” European Centre for Disease Prevention and Control, Stockholm, 2012.

[3] T. Kistemann, “Hygienisch-mikrobiologische Risiken von Großgebäude-Wasserinstallationen,” Bonn, Germany, 2004.

[4] S. Völker, C. Schreiber, and T. Kistemann, “Drinking water quality in household supply infrastructure--A survey of the current situation in Germany,” Int. J. Hyg. Environ. Health, vol. 213, no. 3, pp. 204–209, Jun. 2010.

[5] “List of Legionnaires’ disease outbreaks,” Wikipedia, the free encyclopedia. 25-Jan-2014.

[6] Wikipedia, “Legionellose-Ausbruch in Warstein 2013,” Wikipedia. 10-Jan-2014.

[7] ISO, “ISO 11731. Water quality - detection and enumeration of Legionella,” International Organization for Standardization, Geneva, Switzerland, 2004.

[8] C. A. Boulanger and P. H. Edelstein, “Precision and accuracy of recovery of Legionella pneumophila from seeded tap water by filtration and centrifugation.,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 61, no. 5, pp. 1805–1809, May 1995.

[9] R. H. Bentham, “Routine sampling and the control of Legionella spp. in cooling tower water systems.,” Curr. Microbiol., vol. 41, no. 4, pp. 271–275, Oct. 2000.

[10] C. Napoli, R. Iatta, F. Fasano, T. Marsico, and M. T. Montagna, “Variable bacterial load of Legionella spp. in a hospital water system,” Sci. Total Environ., vol. 408, no. 2, pp. 242–244, Dec. 2009.

[11] C. E. Lucas, T. H. Taylor Jr, and B. S. Fields, “Accuracy and precision of Legionella isolation by US laboratories in the ELITE program pilot study,” Water Res., vol. 45, no. 15, pp. 4428–4436, Oct. 2011.

[12] J. D. Oliver, “Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria,” FEMS Microbiol. Rev., vol. 34, no. 4, pp. 415–425, Jul. 2010.

[13] S. Allegra et al., “Evaluation of an immunomagnetic separation assay in combination with cultivation to improve Legionella pneumophila serogroup 1 recovery from environmental samples,” J. Appl. Microbiol., Jan. 2011.

[14] S. Allegra, F. Berger, P. Berthelot, F. Grattard, B. Pozzetto, and S. Riffard, “Use of flow cytometry to monitor Legionella viability,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 74, no. 24, pp. 7813–7816, Dec. 2008.

[15] B. Bendinger and J. Benölken, “Prexisnahe Untersuchungen zur Kontamination von Trinkwasser in halbtechnischen Trinkwasser-Installationen,” presented at the 24. Mühlheimer Wassertechnisches Seminar, Mühlheim, 19-May-2010.

[16] F. Hammes, M. Berney, Y. Wang, M. Vital, O. Köster, and T. Egli, “Flow-cytometric total bacterial cell counts as a descriptive microbiological parameter for drinking water treatment processes,” Water Res., vol. 42, no. 1–2, pp. 269–277, Jan. 2008.

[17] F. Hammes and T. Egli, “Cytometric methods for measuring bacteria in water: advantages, pitfalls and applications,” Anal. Bioanal. Chem., vol. 397, no. 3, pp. 1083–1095, Jun. 2010.

* *Dr. H.-A. Keserue, A.-K. Ehlert & Dr. D. Schaffhauser: rqmicro AG, 8952 Schlieren/Schweiz

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