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UHPLC

Lösungsmittelersparnis durch UHPLC mit 1-mm-ID-Trennsäule

| Autor/ Redakteur: Steffen Wiese*, Sascha Giegold** et.al. / Marc Platthaus

Moderne UHPLC-Systeme lassen sich bei einfachen Trennproblemen und Anwendung eines Lösungsmittelgradienten problemlos mit 1-mm-ID-Trennsäulen betreiben. Wie effizient sind diese Trennungen und kann man gleichzeitig Lösungsmittel einsparen?

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Abb.1: Wie lassen sich bei modernen UHPLC-Systemen (im Bild das Nexera X2 von Shimadzu) Lösungsmittel einsparen?
Abb.1: Wie lassen sich bei modernen UHPLC-Systemen (im Bild das Nexera X2 von Shimadzu) Lösungsmittel einsparen?
(Bild: Shimadzu)

Eine der grundlegendsten Neuerungen in der Flüssigchromatographie war die Einführung der Ultra-High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) im Jahre 2004. Erstmals war es möglich, chromatographische Trennungen bei hohem Druck (1000 bar) und mit kleinen Partikeln (sub-2 µm) durchzuführen. Dadurch konnten sehr schnelle, hoch effiziente und sensitive Trennungen realisiert werden. Die konsequente Minimierung aller relevanten Systemvolumina hat dazu geführt, dass UHPLC-Systeme ideal für Trennsäulen mit einem Innendurchmesser (ID) von 2,1 mm und sub-2-µm-Partikeln geeignet sind.

Darüber hinaus wurden die UHPLC-Systeme in den letzten zehn Jahren stetig durch die Gerätehersteller weiterentwickelt, um die Bandenverbreiterung der Peaks außerhalb der Trennsäule zu reduzieren. Vor diesem Hintergrund wurden u.a. Detektorzellen optimiert und Edelstahlkapillaren mit einem Innendurchmesser ≤ 100 µm entwickelt. Dadurch können diese Systeme bei einfachen Trennproblemen und bei Anwendung von Lösungsmittelgradienten mittlerweile auch mit 1-mm-ID-Trennsäulen betrieben werden. Die resultierende Lösungsmittelersparnis und verbesserte Kompatibilität zur Massenspektrometrie werden im weiteren Verlauf diskutiert.

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Experimenteller Teil – UHPLC

Für die flüssigchromatographischen Messungen wurde ein Nexera UHPLC-System von Shimadzu verwendet. Das modular aufgebaute System bestand aus zwei LC-30 AD Pumpen, einem SIL-30 AC Autosampler, einem CTO-30 AC Säulenofen, einem SPD-M30A Diodenarray-Detektor sowie einem CBM-20A System-Controller. Die Anlagensteuerung sowie die Datenauswertung erfolgte mithilfe der Labsolutions-Software Version 5.57. Die Versuche wurden auf zwei Agilent Zorbax Stablebond C-18-Trennsäulen (50 × 2,1 mm, 1,8 µm sowie 50 × 1 mm, 1,8 µm) mit unterschiedlichen Innendurchmessern durchgeführt (freundliche Überlassung von Herrn Dr. Bernd-Walter Hoffmann und Herrn Dr. Edgar Nägele, Agilent Technologies). Als Testgemisch wurde ein zertifizierter Standard von Sigma-Aldrich (47651-U) genutzt, der aus 13 Aldehyd- und Keton-2,4-Dinitrophenylhydrazonen (2,4-DNPH) bestand. Die Einzelsubstanzen des Gemischs sind in Tabelle 1 aufgeführt. Vor der Injektion wurde der Standard um den Faktor 10 mit einem Lösungsmittelgemisch bestehend aus 60/40 (v/v) Wasser/Aceton verdünnt. Die Methodenentwicklung erfolgte mithilfe der Drylab-Software (Molnár-Institute for applied chromatography) unter Berücksichtigung des organischen Lösungsmittelanteils in der mobilen Phase sowie der Temperatur.

Ergebnisse und Diskussion

Im ersten Schritt wurde eine Methode zur Trennung der Aldehyd- und Keton-2,4-DNPHs auf einer 2,1-mm-ID-Trennsäule mithilfe der Drylab-Software entwickelt (s. Abb. 2a). Bei den mit einem Stern gekennzeichneten Peaks handelt es sich um Verunreinigungen des Standards, welche bei der Methodenentwicklung nicht berücksichtigt wurden. Die Trennung der Analyten gelingt innerhalb von 3,5 min mit einer kritischen Auflösung von 1,41 zwischen den Peaks 7/8. Aufgrund der hohen Flussrate von 1,2 ml min-1 und der mit 1,8-µm-Partikeln gepackten Säule wird ein Maximaldruck von 1080 bar während des Lösungsmittelgradienten erreicht. Um die in Abbildung 2a gezeigte Methode auf eine Trennsäule mit einem ID von 1 mm ohne Effizienzverlust zu übertragen, ist es erforderlich, die Systemvolumina des UHPLC-Systems weiter zu reduzieren. Vor diesem Hintergrund wurde die Konfiguration des Shimadzu SIL-30 AC Autosamplers von einer Direktinjektion auf eine „fixed loop“-Injektion geändert. Dadurch wird der von der Probenbande durchströmte Flussweg als auch das Gradientenverweilvolumen reduziert. Aufgrund der Tatsache, dass sich die in dieser Studie verwendeten Trennsäulen lediglich in ihrem Innendurchmesser unterscheiden, war für den Methodentransfer nur die Reduzierung der Flussrate von 1,2 ml min-1 auf 0,272 ml min-1 erforderlich. Das Gradientenprofil musste nicht verändert werden.

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