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SPECIAL DETEKTION

Markierung überflüssig - neue Verfahren zur Proteindetektion

| Autor/ Redakteur: Dr. CHRISTIAN HOFFMANN* / Marc Platthaus

Für das Bestimmen der im menschlichen Körper enthaltenen Proteine und ihrer Wechselwirkungen benötigt die Forschung standardisierte, schnelle Detektionsverfahren.

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Abb.1: Mit OregonGreen markiertes Streptavidin gespottet in acht unterschiedlichen Konzentrationen, d(solid pin) = 150 µm. Der identische Array wurde im sichtbaren (511/530) und im UV (280/340) ausgelesen. Unten ist die Integralauswertung der Dots dargestellt.
Abb.1: Mit OregonGreen markiertes Streptavidin gespottet in acht unterschiedlichen Konzentrationen, d(solid pin) = 150 µm. Der identische Array wurde im sichtbaren (511/530) und im UV (280/340) ausgelesen. Unten ist die Integralauswertung der Dots dargestellt.
( Archiv: Vogel Business Media )

Nach der allgemeinen Euphorie über die Entschlüsselung des menschlichen Genoms steht die Forschung vor einer weiteren Mammutaufgabe: Es gilt, die geschätzten einhunderttausend unterschiedlichen Proteine im menschlichen Körper zu bestimmen und vor allem deren komplexe Wechselwirkungen zu erforschen. Für diese gewaltige Aufgabe benötigt die Protein-Forschung standardisierte, schnelle Detektionsverfahren.

Raupe und Schmetterling - ein Genom, zwei Erscheinungsformen. Ginge es allein nach dem Genom der Tierchen, wäre deren wundersame Verwandlung undenkbar. Denn das Genom ist nicht mehr als ein statischer Bauplan für die eigentlichen Akteure im zellulären Stoffwechsel: Die Proteine. Sie verfügen über ein beeindruckendes Repertoire an molekularen Verfahren, um die im Genom codierten Vorgaben in biologische Prozesse umzusetzen. Kleinste Fehlfunktionen von Proteinen können dabei über Leben und Tod entscheiden. Vor allem die medizinische Forschung, Diagnostik und Therapie setzt daher große Hoffnungen in die Erforschung des menschlichen Proteoms.

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Allein im menschlichen Organismus gibt es etwa einhunderttausend unterschiedliche Proteine, zusammengesetzt aus zwanzig natürlichen Aminosäuren [1]. Die Proteine sind den Genen nicht nur zahlenmäßig weit überlegen; sie verändern sich abhängig von Umgebungseinflüssen und treten untereinander in Wechselwirkung. Die vielfältigen Zustände und Interaktionsformen von Proteinen im menschlichen Körper zu erforschen, ist eine Mammutaufgabe - unlösbar ohne den Einsatz innovativer Trenn- und Detektionstechniken sowie hochleistungsfähiger Bioinformatik. Zahlreiche Firmen arbeiten weltweit an Geräten für effiziente, zuverlässige und vergleichbare Analysen von Proteinen. Die meisten Verfahren basieren auf Fluoreszenzmarkierung und der photometrischen Erfassung der Zielmoleküle. Das Fraunhofer Institut für Physikalische Messtechnik (IPM), Freiburg, hat zwei neuartige, markierungsfreie Verfahren zur Protein-Detektion entwickelt.

UV-BiochipreaderDie chipbasierte Fluoreszenz-Messtechnik hat sich im Bereich der DNA-Analytik als Standardverfahren etabliert. Sie garantiert schnelle, standardisierte Analysen von hoher Parallelität [2]. Der Umgang mit Proteinen gestaltet sich jedoch im Vergleich zur DNA wesentlich sensibler. Markiert man ein Protein - sei es etwa über Fluoreszenzfarbstoffe oder Enzyme - ändert sich häufig dessen dreidimensionale Struktur und dadurch seine biologische Aktivität. Insbesondere wenn man das Protein über einen auf einem Oberflächensubstrat immobilisierten Antikörper nachweisen möchte, ist es entscheidend, dass das Protein seine ursprüngliche Struktur behält. Während DNA durch die PolymeraseKettenreaktion (PCR) amplifiziert werden kann, sind Proteine häufig nur in geringsten Mengen verfügbar. Daher ist es von Vorteil, die Proteinprobe ohne weiteren Markierungsschritt zu untersuchen. Warum also nicht die Eigenfluoreszenz von Proteinen für die Chiptechnologie nutzen?

Die Fluoreszenz von Proteinen ist vor allem auf die Aminosäure Tryptophan, aber auch auf die aromatischen Aminosäuren Tyrosin und Phenyl-alanin zurückzuführen. 99,5 Prozent aller Proteine mit Molekularmassen größer als 10 kDa enthalten mindestens ein Tryptophan oder Tyrosin [3]. Auch auf den Nachweis über einen markierten Sekundär-Antikörper, der als Reportermolekül für die Detektion dient, kann dann verzichtet werden.

Die Anregungswellenlänge 280 nm wird aus dem Spektrum einer HgXe-Bogenlampe durch einen Interferenzfilter herausgefiltert und der Chip über vier Lichtwellenleiter gleichmäßig ausgeleuchtet. Ein zweiter Interferenzfilter selektiert das Fluoreszenzlicht der Probe bei 340 nm; dieses wird von einer UV-empfindlichen, hochauflösenden CCD-Kamera als Bild aufgenommen.

Getestet wurde diese Technik am Protein Streptavidin und einem Antikörper-Antigen-System aus Candida albicans, einem Erreger endogener Pilzinfektionen. Um die Detektion der Protein-Eigenfluoreszenz mit der Detektion fluoreszenzmarkierter Proteine vergleichen zu können, wurde fluoreszenzmarkiertes Streptavidin (Farbstoff: OregonGreen) in verschiedenen Konzentrationen auf eine Siliziumoxidoberfläche gespottet. In Abbildung 1 ist das Bild der UV-Fluoreszenz bei 280nm/340nm (Abb. 1, rechts) mit dem Fluoreszenzsignal von OregonGreen bei 511nm/530nm (Abb. 1, links) des identischen Chips verglichen. Aus der quantitativen Auswertung ergibt sich, dass die Eigenfluoreszenz nur um Faktor fünf schlechter detektierbar ist als die Fluores-zenz des Markermoleküls. Dargestellt sind jeweils die Proteinarrays (Abb. 1, oben) sowie die zugehörigen Kalibrierkurven, wobei für jede Konzentration der Mittelwert aus acht Spots identischer Konzentration gebildet wurde (Abb. 1, unten). Die Nachweisempfindlichkeit des Systems liegt derzeit bei etwa 4000 Molekülen/µm2 für das Modellprotein Streptavidin.

Weiterhin wurden in Zusammenarbeit mit dem Fraunhofer Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik (IGB) Antikörper-Antigen-Reaktionen mittels UV-Detektion untersucht. Silica-Partikel wurden dazu mit Protein G beschichtet, dann der Antikörper IgG (Immunglobulin G, anti-TSA) immobilisiert und die modifizierten Partikel schließlich mit dem Antigen TSA (Thiolspezifisches antioxidierendes Protein) inkubiert. Nach jedem Schritt wurde jeweils eine Charge mit BSA (Bovine Serum Albumin) geblockt. Die verschiedenen Partikel wurden nun als Suspension auf eine mit positiv geladener Polyelektrolytschicht modifizierte Siliziumoxidoberfläche gespottet. Vor der Messung wurde der Chip mit destilliertem Wasser gewaschen und mit Stickstoff abgeblasen. Abbildung 2 zeigt das Reaktionsschema und das UV Bild der Spots. Während der Signalzuwachs durch IgG nicht detektierbar ist, ist das erhöhte Signal durch TSA deutlich zu erkennen. Damit ist die Anbindung des Antigens TSA eindeutig nachweisbar und somit ein wichtiger Schritt im Hinblick auf die markierungsfreie Detektion einer Immunreaktion gelungen.

Viel versprechend ist der Einsatz dieses Messsystems in der Immunsensorik. Während die Anwendungen der Proteinanalytik derzeit klar im Forschungsbereich liegen, sollte es mit den Ergebnissen der laufenden Forschungsarbeiten möglich sein, in den Diagnostikbereich vorzudringen und ein System zu entwickeln, welches beispielsweise für die Detektion von Markerproteinen in der klinischen Diagnostik (z.B. Sepsismarker, Tumormarker) eingesetzt werden kann.

Interferometrischer BiosensorWährend die markierungsfreie, chipbasierte Detektion von Proteinen im UV-Spektralbereich ein neuartiges Verfahren darstellt, existieren dagegen seit mehreren Jahren markierungsfreie Detektionsverfahren zur zeitabhängigen Erfassung biochemischer Reaktionen wie beispielsweise die Oberflächen-Plasmonenresonanz-Sensoren (Surface Plasmon Resonance, SPR) [4], die Gitterkoppler [5] und die reflektometrische Interferenz-Spektroskopie (RIfS) [6].

Dem Fraunhofer IPM ist mit einem Interferometrischen Biosensor (IBS) die Entwicklung eines Echtzeit-Mess-Systems gelungen, das sensitiver als die oben genannten Methoden ist. Das Messprinzip basiert auf dem optischen System eines Young-Interferometers. Zentrales Bauelement des IBS ist ein Transducer Chip, basierend auf einem Ta2O5-Wellenleiter. Das Licht einer roten Superlumineszenzdiode wird über ein Gitter in den Chip eingekoppelt. In dem Dünnschichtwellenleiter werden zwei Teilstrahlen geführt (Abb. 3). Während einer der Strahlen als Referenz dient, sind auf dem Wellenleiter im Bereich des anderen Strahls Fängermoleküle (z.B. Antikörper) immobilisiert. Wird nun der Analyt zugeführt, so werden die Zielmoleküle (z.B. Antigene) an der Chipoberfläche gebunden. Ist eine Anlagerung erfolgt, ändert sich die Massenbelegung auf der Chipoberfläche.

In der Folge reduziert sich lokal begrenzt die Phasengeschwindigkeit des Lichts im Wellenleiter. Über ein Gitter werden die Teilstrahlen wieder ausgekoppelt und über einen Doppelspalt die beiden Teilstrahlen zur Interferenz gebracht. Kam es zu einer Anbindungsreaktion, verschiebt sich das Interferenzmuster, das mit einer CCD-Zeile detektiert wird. Da sich die Messung immer auf eine Referenz bezieht, ist das Gerät weitgehend unempfindlich gegenüber äußeren Einflüssen wie Temperaturänderungen. Auch unspezifische Anbindungsreaktionen oder Änderungen im Brechungsindex der Lösung werden ausgeglichen.

Bislang konnte in Testläufen mit Glycerin gezeigt werden, dass das System eine effektive Brechzahländerung von 3x10-8 detektieren kann (Abb. 4). Das entspricht in der Oberflächenbelegung einer Größenordnung von wenigen 100 fg/mm2. In einem weiteren Versuch wird die Detektion der unspezifischen Adsorption von BSA auf der Chipoberfläche gezeigt. Zunächst wird Pufferlösung (PBS) pH 7,2 über die Oberfläche geführt. Wird BSA der Pufferlösung zugegeben, so bindet es unspezifisch, und der zeitliche Verlauf dieser Anlagerungsreaktion kann verfolgt werden. Lässt man wiederum nur PBS über den Sensor strömen, bleibt das BSA an der Oberfläche adsorbiert. Erst durch Änderung des pH-Werts (50 mM NaOH) löst sich das BSA von der Sensoroberfläche.

Die Ergebnisse zeigen, dass Anbindungsreaktionen an der Sensoroberfläche hervorragend nachweisbar sind, und es ist zu erwarten, dass der IBS in biologischen Tests sensitiver ist als das Gitterkoppler- oder das SPR-System. Ein auf Mikrotiterplattenformate zugeschnittener Aufbau ist bereits in der konzeptionellen Planung.

Einfache und effiziente Verfahren wie der UV-Biochip-Reader und der interferometrische Biosensor sind hervorragend geeignet, Reaktionen von Proteinen zu untersuchen. Im Laboralltag lassen sich mit solch innovativen Verfahren Verbrauchs- und Probenmaterialien sowie Reagenzien und damit Kosten sparen.

Welche Verfahren sich am Markt durchsetzen, wird vor allem auch die Praxis in den Labors zeigen. Die Erkenntnisse und technischen Fortschritte aus der Entschlüsselung von Genom und Proteom sind wertvolle Grundlagen für die kommenden Herausforderungen der Bioanalytik, die sich bereits am Horizont abzeichnen: Die Beobachtung und Analyse dynamischer Vorgänge in Zellen und Zellverbänden. Gelingt es, das komplexe Zusammenspiel von Genen und Proteinen in der Zelle zu verstehen, wird man vielleicht eines Tages ergründen, was bei der wundersamen Verwandlung von der Raupe zum Schmetterling tatsächlich passiert.

Literatur[1] Deutsches Humangenomprojekt, Gene und Proteine: vom Code zur Funktion,http:// www.dhgp.de/deutsch/medien/index.html[2] A. Brandenburg, A. Braun, C. Hoffmann, Schnelle DNA-Analyse: Readersysteme für medizinische Forschung und Diagnostik, GIT Labor-Fachzeitschrift 46/3 (2002), 287- 289.[3] J. Roegener, P. Lutter, R. Reinhardt, M. Blüggel, H. Meyer and D. Anselmetti, Ultrasensitive detection of unstained proteins in acryl amide gels by native UV fluorescence, Anal. Chem. 75, (2003) 157-159.[4] R. J. Green, R. A. Frazier, K. M. Shakesheff, M. C. Davies, C. J. Roberts, S. J. B. Tendler, Surface plasmon resonance analysis of dynamic biological interactions with biomaterials, Biomaterials 21 (2000) 1823-1835. [5] J. Piehler, A. Brandenburg, A. Brecht, E. Wagner, G. Gauglitz, Characterization of grating couplers for affinity-based pesticide sensing, Applied Optics 36 (1997) 6554- 6562.[6] C. Hänel, G. Gauglitz, Comparison of reflectometric interference spectroscopy with other instruments for label-free optical detection, Analytical and Bioanalytical Chemistry 372 (2002) 91-100.

* Marketing Bioanalytik, Fraunhofer-Institut für Physikalische Messtechnik (IPM), Heidenhofstraße 8, 79110 Freiburg

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