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Imaging-System Messung von Sauerstoffgradienten über einer Algenzellschicht

Autor / Redakteur: Cindy Ast*, Carola Päpke* und Joost T. van Dongen* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Eine der Grundvoraussetzungen für das langfristige Überleben einer Zelle ist molekularer Sauerstoff, als notwendiges Substrat für die Energiegewinnung – d.h. die Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) – durch Atmung. Mit einem neuen Imaging-System lässt sich nun der Sauerstoffgradient in Pufferlösungen visualisieren.

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Abb. 1: Versuchsaufbau: Die Nahaufnahme auf der rechten Seite zeigt die Visisens-Detektoreinheit DU01. In der transparenten Plastiktüte kann man die beiden Testgefäße mit Chlamydomonas-Zellen erkennen.
Abb. 1: Versuchsaufbau: Die Nahaufnahme auf der rechten Seite zeigt die Visisens-Detektoreinheit DU01. In der transparenten Plastiktüte kann man die beiden Testgefäße mit Chlamydomonas-Zellen erkennen.
(Bild: MPI für Molekulare Pflanzenphysiologie, Potsdam-Golm)

Molekularer Sauerstoff ist für die Energiegewinnung durch Atmung essenziell. Bekommt eine Zelle zu wenig Sauerstoff, wird in Folge dessen die ATP-Produktion gehemmt, was letztendlich zum Zelltod führen kann. Obwohl Pflanzen bei Licht durch Photosynthese selbst Sauerstoff produzieren können, reagieren Pflanzenzellen sehr empfindlich auf Sauerstoffmangel. Pflanzen verfügen über kein effektives Verteilungssystem, das Sauerstoff zu den Geweben transportiert, in denen er am meisten benötigt wird. Dadurch kann die interne Sauerstoffkonzentration extrem weit absinken. Pflanzen besitzen verschiedene metabolische Anpassungsprozesse bei Sauerstoffmangel. Energieaufwendige Speicherprozesse werden zurückgeregelt und Stoffwechselabläufe werden auf die ökonomischsten Bahnen umgestellt. Durch diese metabolischen Anpassungen wird die ATP-Produktionsrate reduziert und damit der Sauerstoffbedarf für die Zellatmung verringert. Derzeit wird diskutiert, ob diese Reduktion des Sauerstoffverbrauchs durch Atmung bei Hypoxie eine direkte Folge des Sauerstoffmangels ist, oder ob aktive Regulationsmechanismen existieren, die Sauerstoff sparen und somit verhindern, dass Zellen in einen Zustand kompletten Sauerstoffmangels geraten. Eine Grundvoraussetzung für aktive Regulation des Sauerstoffverbrauchs ist ein zellulärer Mechanismus zur Ermittlung der Sauerstoffverfügbarkeit. Tatsächlich wurde vor kurzem in Pflanzenzellen ein Sensor- oder Signalprozess zur Ermittlung der Sauerstoffverfügbarkeit entdeckt. Dennoch muss der experimentelle Beweis, dass Pflanzenzellen tatsächlich in der Lage sind, durch Reduktion des Sauerstoffverbrauchs unter Sauerstoffmangel molekularen Sauerstoff einzusparen, noch erbracht werden.

Da es kaum möglich ist, die tatsächliche Sauerstoffkonzentration in und um vielschichtiges Pflanzengewebe zu bestimmen, ohne das Gewebe dabei zu beeinflussen, wurde eine flüssige Zellkultur der Alge Chlamydomonas reinhardtii für diese Experimente benutzt. Eine Sauerstoff-Sensorfolie wurde auf der Innenwand des Testgefäßes angebracht und die Sensorantwort kontinuierlich mit der Visisens-Detektoreinheit von außen – also nicht invasiv – aufgezeichnet. Damit sollten Sauerstofffluktuationen im Medium über der Zellschicht ermittelt werden, um herauszufinden, ob respiratorisch aktive Pflanzenzellen ihren Sauerstoffverbrauch an variierende Sauerstoffverfügbarkeit in ihrer Umgebung anpassen können.

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Material und Methoden

Zellen eines unbeweglichen Stammes der grünen Alge Chlamydomonas rheinhardtii wurden in zwei gerade Glasfläschchen pipettiert. Innerhalb von vier Stunden bildeten die Zellen eine homogene Zellschicht auf dem Flaschenboden. Der Überstand wurde vorsichtig abpipettiert und durch Puffer mit einer entweder hohen oder niedrigen Konzentration an Azetat als Atmungssubstrat ersetzt. Die Glasfläschchen wurden in eine transparente Plastiktüte gestellt, die mit vorgemischter Luft mit verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen gefüllt werden konnte, und von Licht abgeschirmt (s. Abb. 1). Die Sauerstoffkonzentration in der Puffersäule über der Zellschicht wurde kontinuierlich überwacht. Dazu wurde ein schmaler Streifen Sauerstoff-Sensorfolie (SF-RPSU4, Presens) auf der Innenseite der Glasfläschchen angebracht (s. Abb. 4) und mit der Visisens-Detektoreinheit ausgelesen. 21% (v/v) und 4% (v/v) Sauerstoffkonzentration wurden im Luftstrom eingeleitet und Messungen über 24 Stunden durchgeführt.

Wenn die Sauerstoffkonzentration in der Luft um die Glasfläschchen bei 21% (v/v) gehalten wurde, bildete sich in der Pufferlösung über der Algenzellschicht ein Sauerstoffgradient aus (s. Abb. 2A).

Sauerstoffverbrauch von Algen

Der Anstieg des Gradienten korrelierte nicht mit der Kohlenwasserstoff-Nährstoff-Konzentration in der Pufferlösung. Als jedoch die Sauerstoffkonzentration um die Glasflasche auf 4% (v/v) reduziert wurde, fiel die Sauerstoffkonzentration im Puffer rapide ab, und es konnte eine homogene Sauerstoffverteilung in der ganzen Flasche festgestellt werden. Interessanterweise blieb die Sauerstoffkonzentration in dem Glasfläschchen, dessen Pufferlösung wenig Azetat enthielt, höher als in dem Fläschchen mit hoher Acetatkonzentration. Offensichtlich sorgte die Kombination aus geringer Nährstoffkonzentration mit einem geringen Sauerstoffniveau für eine stärkere Abnahme des Sauerstoffverbrauchs in den Zellen, als vergleichsweise bei Zellen, die viel Nährstoff zur Verfügung hatten.

Schlussfolgerung

Aus diesen Experimenten lässt sich schließen, dass der Sauerstoffverbrauch durch Atmung bei Einschränkungen variieren kann. Dennoch scheint die Verfügbarkeit von Nährstoffen sehr viel stärkeren Einfluss als die Sauerstoffverfügbarkeit zu haben. Das Visisens-System ermöglichte es, die Sauerstoffkonzentration über der Algenzellschicht zweidimensional darzustellen. Die aufgenommenen Bilder ließen erste Schlussfolgerungen über den Sauerstoffverbrauch in den Pflanzenzellen zu. Das Gerät ist einfach anzuwenden und kann bei der Untersuchung des Sauerstoffverbrauchs von Pflanzen wertvolle Daten generieren. Gerade die Möglichkeit, Veränderungen in der Sauerstoffkonzentration nicht nur über längere Zeiträume sondern zudem auch zweidimensional zu überwachen, ist ein entscheidender Vorteil des Systems.

* C. Ast, C. Päpke und J. T. van Dongen: Max Planck Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie, Potsdam-Golm

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