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Stoffwechsel Metabolomik-Forschung: Störungsfrei extrahieren und filtrieren

| Autor / Redakteur: Koen Sandra et al.* / Dr. Ilka Ottleben

Im Rahmen metabolomischer Studien müssen häufig große Probensätze analysiert werden, um eine statistische Differenzierung der Probenarten zu ermöglichen. Wichtig ist die Wiederholbarkeit des Arbeitsablaufs. Die Automatisierung der Probenvorbereitung hilft, analytische Schwankungen zu reduzieren.

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Abb. 1A: Eine Aliquote des Extraktes wird vom Gerstel-Multi-Purpose-Sampler (MPS) aus dem Probenvial (aus der Innenseite des Siebfilters) überführt ....
Abb. 1A: Eine Aliquote des Extraktes wird vom Gerstel-Multi-Purpose-Sampler (MPS) aus dem Probenvial (aus der Innenseite des Siebfilters) überführt ....
(Bild: Research Institute for Chromatography)

Metabolomische Studien fokussieren auf die Analyse kleiner Moleküle (MG < 2000) in biologischen Matrices aus Mikroorganismen, Pflanzen, Tieren und Menschen. Relativ große Probensätze müssen verarbeitet werden, um eine Differenzierung der Probenarten zu ermöglichen, und es ist von größter Wichtigkeit, die analytische Schwankung geringer zu halten, als es die biologische Variabilität von Natur aus ist. Die Automatisierung der Probenvorbereitung kann dazu beitragen, die Wiederholbarkeit des gesamten analytischen Verfahrens zu verbessern.

Ein typischer metabolomischer Arbeitsablauf schließt klassischerweise verschiedene Arbeitsschritte wie Extraktion, Fraktionierung oder Aufreinigung, Derivatisierung und Aufkonzentrierung der Anayten ein, gefolgt von der gas- bzw. flüssigchromatographischen (GC/LC) Trennung mit massenspektrometrischer Detektion (MS).

Fokus auf die Automatisierung

Für die Extraktion von Pflanzenmaterial ist die ultraschallgestützte Flüssigextraktion eine weitverbreitete Methode. Die Ultraschallextraktion wird dabei allerdings meist noch von Hand ausgeführt. Dieser Umstand ist zum Teil der Tatsache geschuldet, dass feste Partikel in der Extraktionslösung eine Suspension bilden, die Spritzen leicht zusetzen und verstopfen können. Das kann natürlich letztlich die Resultate, etwa beim Sammeln von Extrakten oder bei der Probenaufgabe in ein GC- oder LC-System, unzuverlässig machen.

Allerdings gibt es Mittel, mit denen sich das Verstopfen der Spritze wirksam verhindern lassen: Mit der Anwendung von kürzlich eingeführten Werkzeugen für den Gerstel-Multi-Purpose-Sampler (MPS), einen in alle drei Raumrichtungen agierenden Probenvorbereitungsroboter, lassen sich Extraktion, Filtration und alle weiteren Probenvorbereitungsschritte von aus metabolomischer Sicht interessanten Extrakten zuverlässig automatisieren.

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Illustriert wird dieser Sachverhalt durch ein automatisiertes Probenvorbereitungsprotokoll, das für die Ultraschallextraktion von Glykosiden und Phenolverbindungen aus Pflanzenmaterial für eine metabolomische Studie entwickelt wurde. Unter der Bezeichnung Glycoside wird eine große Gruppe von Pflanzenstoffen und synthetischen Verbindungen subsummiert, die beim Kochen in Wasser oder verdünnten Säuren sowie enzymatisch u.a. in Einfach- und Mehrfachzucker sowie Nicht-Zucker (Aglycone) aufgespalten werden.

In Pflanzen scheinen Glycoside unterschiedliche biologische Aufgaben zu erfüllen: Sie wirken als Zuckerdepot, können Pflanzenfarbstoffe, hierzu zählen beispielsweise die zu den Phenolen gerechneten Flavonoide, stabilisieren oder schädliche Stoffwechselprodukte binden [1]. Die Implementierung von Siebfiltern zur Verhinderung der Blockade der MPS-Spritze zusammen mit der Filtration des Extraktes durch ein 0,45-µm-Filter erlaubt die direkte Injektion der beschallten und gefilterten Proben in ein LC/MS-System.

Störungsfreie Extraktion

Fallbeispiel: Eine 60-mg-Probe von gemahlenem Pflanzenmaterial wird in ein 10-mL-Headspace-Vial eingewogen. Vor dem Verschließen des Vials wird ein 17-µm-Edelstahlsiebfilter (Gerstel) in das Vial eingesetzt. Es folgen die automatisierte Extraktion und Filtration mit der MPS-Dual-Head-Workstation. Das Extraktionslösemittel (5,8 mL von 75/25 Methanol/Wasser) wird mit einer 2,5-mL-Spritze hinzugefügt, der interne Standard (0,2 mL) anschließend mit einer 1,0-mL-Spritze. Zu beachten ist, dass kein Spritzenwechsel erfolgen muss, weil die MPS-Workstation über zwei Arme verfügt und somit mühelos unterschiedliche Volumina gehandhabt werden können. Das Vial wird dann vom MPS zum Ultraschallbad transportiert und 30 Minuten lang beschallt. Eine Aliquote des Extraktes (400 µL) wird vom MPS aus dem Probenvial (aus der Innenseite des Siebfilters) überführt und durch einen 0,45-µm-Einweg-Spritzenfilter gefiltert (s. Abb. 1). Abbildung 2 zeigt die Probenvials vor und nach der Probenvorbereitung. Die Analyse der Extrakte erfolgte mit einem Agilent UPLC-System 1290, das gekoppelt war mit einem Q-TOF-LC/MS 6540. Eine Umkehrphasentrennung erfolgte auf einer C18-Säule mit Wasser, Acetonitril und Ameisensäure als Bestandteile der mobilen Phase.

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