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Stoffwechsel

Metabolomik-Forschung: Störungsfrei extrahieren und filtrieren

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Filteroption bringt mehr Sicherheit

Für eine Metabolomikstudie über Glykoside und Phenolverbindungen in Pflanzenmaterial wurden 86 Proben unter Verwendung der oben beschriebenen automatisierten Prep-Sequenz bereitet. Von den 86 Proben waren 18 Qualitätskontrollproben (QK), die dazu dienten, die Reproduzierbarkeit des Probenvorbereitungs- und LC/MS-Protokolls zu bewerten.

Die Kombination der aufeinanderfolgenden Filtrationsschritte ermöglichte eine unbeaufsichtigte fehlerfreie Probenvorbereitungs- und Injektionssequenz aller 86 Proben; die wiederverwendbaren Siebfilter innerhalb der Probenvials verhinderten das Verstopfen der MPS-Spritzennadel.

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Der flüssige Extrakt (Methanol/Wasserlösung) war nach der Ultraschallbehandlung trüb (s. Abb. 2), was eine zusätzliche Filtration erforderlich macht. Diese wurde effizient ausgeführt mit einem 0,45-µm-Einweg-Spritzenfilter. Abschließend erhält man einen klaren Extrakt, der in das LC-QTOF-System injiziert werden kann. Alle 86 Proben wurden ohne einen Druckanstieg im UHPLC-System 1290 analysiert, sprich: es kam zu keinerlei Ablagerung.

Chromatographie und Detektion

Mit den QK-Proben wurden sowohl gezielte als auch ungezielte Analysen durchgeführt. Für die gezielten Analysen wurden der interne Standard und eine Anzahl bekannter Verbindungen ausgewählt; die Flächenwiederholbarkeit wurde berechnet; die Ergebnisse waren exzellent. Es ist anzumerken, dass für metabolomische Studien der Cutoff für Flächen-RSD-Werte typischerweise 30 Prozent beträgt. Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, ergeben die Ergebnisse der gezielten Analysen der QK-Proben eine Flächen-RSD von weniger als 14 Prozent für Signale von geringer Intensität, was innerhalb der Grenze für Metabolomikwerte liegt, und weniger als sechs Prozent für Rutin und Chlorogensäure. Bei den ungezielten Analysen wurden 590 Merkmale in Betracht gezogen. Beim Auftragen der Flächen-RSD-Werte gegen die RSD-Grenzwerte (s. Abb. 3) wird klar, dass die Ergebnisse der ungezielten Analysen ebenfalls exzellent waren: 98 Prozent aller Merkmale besitzen Flächen-RSD-Werte, die unter 30 Prozent liegen, was sie für weitere statistische Auswertungen brauchbar macht.

Der Autosampler entscheidet

Wie dieser Bericht aus der Praxis belegt, erweist sich die MPS-Dual-Head-Work-Station als besonders gut geeignet für die automatisierte Probenvorbereitung im Rahmen metabolomischer Studien. Die Kombination von ultraschallgestützter Flüssigextraktion mit einem doppelten Filtrationsprozess führt zu Extrakten, die mittels LC/MS analysiert werden können. Für die Extraktion von Glykosiden aus Pflanzenmaterial wurden mit Erfolg In-Vial-Siebfilter aus Edelstahl verwendet, um ein Zusetzen der Dosier- und Injektionsspritze zu verhindern. Die Extrakte wurden von der Innenseite der Siebfiltereinsätze abgesaugt und einem weiteren automatisierten Filtrationsschritt mit einem 4 mm x 0,45 µm-Spritzenfilter unterworfen, bevor sie in das LC-MS-System injiziert wurden. Den Analysen der Qualitätskontrollproben folgend, die im Rahmen einer Metabolomikstudie ausgeführt wurden, wurde festgestellt, dass die erhaltenen Ergebnisse in hohem Maße wiederholbar sind.

Literatur

[1] Römpp Lexikon, Lebensmittelchemie, 2. Auflage, 2006.

* K. Sandra, F. David, C. Devos, B. Tienpont, P. Sandra: Research Institute for Chromatography, 8500 Kortrijk, Belgien

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