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Stoffwechsel Metabolomik-Forschung: Störungsfrei extrahieren und filtrieren

Autor / Redakteur: Koen Sandra et al.* / Dr. Ilka Ottleben

Im Rahmen metabolomischer Studien müssen häufig große Probensätze analysiert werden, um eine statistische Differenzierung der Probenarten zu ermöglichen. Wichtig ist die Wiederholbarkeit des Arbeitsablaufs. Die Automatisierung der Probenvorbereitung hilft, analytische Schwankungen zu reduzieren.

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Abb. 1A: Eine Aliquote des Extraktes wird vom Gerstel-Multi-Purpose-Sampler (MPS) aus dem Probenvial (aus der Innenseite des Siebfilters) überführt ....
Abb. 1A: Eine Aliquote des Extraktes wird vom Gerstel-Multi-Purpose-Sampler (MPS) aus dem Probenvial (aus der Innenseite des Siebfilters) überführt ....
(Bild: Research Institute for Chromatography)

Metabolomische Studien fokussieren auf die Analyse kleiner Moleküle (MG < 2000) in biologischen Matrices aus Mikroorganismen, Pflanzen, Tieren und Menschen. Relativ große Probensätze müssen verarbeitet werden, um eine Differenzierung der Probenarten zu ermöglichen, und es ist von größter Wichtigkeit, die analytische Schwankung geringer zu halten, als es die biologische Variabilität von Natur aus ist. Die Automatisierung der Probenvorbereitung kann dazu beitragen, die Wiederholbarkeit des gesamten analytischen Verfahrens zu verbessern.

Ein typischer metabolomischer Arbeitsablauf schließt klassischerweise verschiedene Arbeitsschritte wie Extraktion, Fraktionierung oder Aufreinigung, Derivatisierung und Aufkonzentrierung der Anayten ein, gefolgt von der gas- bzw. flüssigchromatographischen (GC/LC) Trennung mit massenspektrometrischer Detektion (MS).

Fokus auf die Automatisierung

Für die Extraktion von Pflanzenmaterial ist die ultraschallgestützte Flüssigextraktion eine weitverbreitete Methode. Die Ultraschallextraktion wird dabei allerdings meist noch von Hand ausgeführt. Dieser Umstand ist zum Teil der Tatsache geschuldet, dass feste Partikel in der Extraktionslösung eine Suspension bilden, die Spritzen leicht zusetzen und verstopfen können. Das kann natürlich letztlich die Resultate, etwa beim Sammeln von Extrakten oder bei der Probenaufgabe in ein GC- oder LC-System, unzuverlässig machen.

Allerdings gibt es Mittel, mit denen sich das Verstopfen der Spritze wirksam verhindern lassen: Mit der Anwendung von kürzlich eingeführten Werkzeugen für den Gerstel-Multi-Purpose-Sampler (MPS), einen in alle drei Raumrichtungen agierenden Probenvorbereitungsroboter, lassen sich Extraktion, Filtration und alle weiteren Probenvorbereitungsschritte von aus metabolomischer Sicht interessanten Extrakten zuverlässig automatisieren.

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Illustriert wird dieser Sachverhalt durch ein automatisiertes Probenvorbereitungsprotokoll, das für die Ultraschallextraktion von Glykosiden und Phenolverbindungen aus Pflanzenmaterial für eine metabolomische Studie entwickelt wurde. Unter der Bezeichnung Glycoside wird eine große Gruppe von Pflanzenstoffen und synthetischen Verbindungen subsummiert, die beim Kochen in Wasser oder verdünnten Säuren sowie enzymatisch u.a. in Einfach- und Mehrfachzucker sowie Nicht-Zucker (Aglycone) aufgespalten werden.

In Pflanzen scheinen Glycoside unterschiedliche biologische Aufgaben zu erfüllen: Sie wirken als Zuckerdepot, können Pflanzenfarbstoffe, hierzu zählen beispielsweise die zu den Phenolen gerechneten Flavonoide, stabilisieren oder schädliche Stoffwechselprodukte binden [1]. Die Implementierung von Siebfiltern zur Verhinderung der Blockade der MPS-Spritze zusammen mit der Filtration des Extraktes durch ein 0,45-µm-Filter erlaubt die direkte Injektion der beschallten und gefilterten Proben in ein LC/MS-System.

Störungsfreie Extraktion

Fallbeispiel: Eine 60-mg-Probe von gemahlenem Pflanzenmaterial wird in ein 10-mL-Headspace-Vial eingewogen. Vor dem Verschließen des Vials wird ein 17-µm-Edelstahlsiebfilter (Gerstel) in das Vial eingesetzt. Es folgen die automatisierte Extraktion und Filtration mit der MPS-Dual-Head-Workstation. Das Extraktionslösemittel (5,8 mL von 75/25 Methanol/Wasser) wird mit einer 2,5-mL-Spritze hinzugefügt, der interne Standard (0,2 mL) anschließend mit einer 1,0-mL-Spritze. Zu beachten ist, dass kein Spritzenwechsel erfolgen muss, weil die MPS-Workstation über zwei Arme verfügt und somit mühelos unterschiedliche Volumina gehandhabt werden können. Das Vial wird dann vom MPS zum Ultraschallbad transportiert und 30 Minuten lang beschallt. Eine Aliquote des Extraktes (400 µL) wird vom MPS aus dem Probenvial (aus der Innenseite des Siebfilters) überführt und durch einen 0,45-µm-Einweg-Spritzenfilter gefiltert (s. Abb. 1). Abbildung 2 zeigt die Probenvials vor und nach der Probenvorbereitung. Die Analyse der Extrakte erfolgte mit einem Agilent UPLC-System 1290, das gekoppelt war mit einem Q-TOF-LC/MS 6540. Eine Umkehrphasentrennung erfolgte auf einer C18-Säule mit Wasser, Acetonitril und Ameisensäure als Bestandteile der mobilen Phase.

Filteroption bringt mehr Sicherheit

Für eine Metabolomikstudie über Glykoside und Phenolverbindungen in Pflanzenmaterial wurden 86 Proben unter Verwendung der oben beschriebenen automatisierten Prep-Sequenz bereitet. Von den 86 Proben waren 18 Qualitätskontrollproben (QK), die dazu dienten, die Reproduzierbarkeit des Probenvorbereitungs- und LC/MS-Protokolls zu bewerten.

Die Kombination der aufeinanderfolgenden Filtrationsschritte ermöglichte eine unbeaufsichtigte fehlerfreie Probenvorbereitungs- und Injektionssequenz aller 86 Proben; die wiederverwendbaren Siebfilter innerhalb der Probenvials verhinderten das Verstopfen der MPS-Spritzennadel.

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Der flüssige Extrakt (Methanol/Wasserlösung) war nach der Ultraschallbehandlung trüb (s. Abb. 2), was eine zusätzliche Filtration erforderlich macht. Diese wurde effizient ausgeführt mit einem 0,45-µm-Einweg-Spritzenfilter. Abschließend erhält man einen klaren Extrakt, der in das LC-QTOF-System injiziert werden kann. Alle 86 Proben wurden ohne einen Druckanstieg im UHPLC-System 1290 analysiert, sprich: es kam zu keinerlei Ablagerung.

Chromatographie und Detektion

Mit den QK-Proben wurden sowohl gezielte als auch ungezielte Analysen durchgeführt. Für die gezielten Analysen wurden der interne Standard und eine Anzahl bekannter Verbindungen ausgewählt; die Flächenwiederholbarkeit wurde berechnet; die Ergebnisse waren exzellent. Es ist anzumerken, dass für metabolomische Studien der Cutoff für Flächen-RSD-Werte typischerweise 30 Prozent beträgt. Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, ergeben die Ergebnisse der gezielten Analysen der QK-Proben eine Flächen-RSD von weniger als 14 Prozent für Signale von geringer Intensität, was innerhalb der Grenze für Metabolomikwerte liegt, und weniger als sechs Prozent für Rutin und Chlorogensäure. Bei den ungezielten Analysen wurden 590 Merkmale in Betracht gezogen. Beim Auftragen der Flächen-RSD-Werte gegen die RSD-Grenzwerte (s. Abb. 3) wird klar, dass die Ergebnisse der ungezielten Analysen ebenfalls exzellent waren: 98 Prozent aller Merkmale besitzen Flächen-RSD-Werte, die unter 30 Prozent liegen, was sie für weitere statistische Auswertungen brauchbar macht.

Der Autosampler entscheidet

Wie dieser Bericht aus der Praxis belegt, erweist sich die MPS-Dual-Head-Work-Station als besonders gut geeignet für die automatisierte Probenvorbereitung im Rahmen metabolomischer Studien. Die Kombination von ultraschallgestützter Flüssigextraktion mit einem doppelten Filtrationsprozess führt zu Extrakten, die mittels LC/MS analysiert werden können. Für die Extraktion von Glykosiden aus Pflanzenmaterial wurden mit Erfolg In-Vial-Siebfilter aus Edelstahl verwendet, um ein Zusetzen der Dosier- und Injektionsspritze zu verhindern. Die Extrakte wurden von der Innenseite der Siebfiltereinsätze abgesaugt und einem weiteren automatisierten Filtrationsschritt mit einem 4 mm x 0,45 µm-Spritzenfilter unterworfen, bevor sie in das LC-MS-System injiziert wurden. Den Analysen der Qualitätskontrollproben folgend, die im Rahmen einer Metabolomikstudie ausgeführt wurden, wurde festgestellt, dass die erhaltenen Ergebnisse in hohem Maße wiederholbar sind.

Literatur

[1] Römpp Lexikon, Lebensmittelchemie, 2. Auflage, 2006.

* K. Sandra, F. David, C. Devos, B. Tienpont, P. Sandra: Research Institute for Chromatography, 8500 Kortrijk, Belgien

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