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Zellkulturentwicklung Microbioreaktor reduziert Zeit- und Kostenaufwand

Autor / Redakteur: MICHAELA McADAM, DOMINIC GRONE* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Im Vergleich zu klassischen Medikamenten sind biopharmazeutisch hergestellte Therapeutika derzeit noch relativ teuer. Neben einer frühzeitigen Selektion von Säugetier- oder Insektenzelllinien, die hohe Proteintiter exprimieren, ermöglicht die Optimierung der Proteingewinnung mithilfe von Microscale-Bioreaktoren eine signifikante Reduktion von Kosten im Entwicklungsprozess.

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Abb. 1b: Die Mikrobioreaktoren in ihrem Rack
Abb. 1b: Die Mikrobioreaktoren in ihrem Rack
(Bild: Sartorius)

Bereits beim Zelllinien-Screening lassen sich durch eine Maximierung der Anzahl von evaluierten Zelllinien die Chancen erhöhen, einen hochergiebigen Klon für proteinbasierte und monoklonale Antikörpertherapien (mAb) zu erhalten.

Für die Auswahl hoch produktiver Zelllinien wurden traditionell Schüttelkolben und Benchtop-Bioreaktoren eingesetzt, unterstützt durch optimale Medien, Zellnahrung und Bioprozess-Bedingungen. Schüttelmethoden ermöglichen jedoch weder eine Kontrolle des pH-Wertes und des gelösten Sauerstoffs (DO) noch gewähren sie das gleiche Mischverhalten wie in einem Bioreaktor. Sie werden oftmals nicht von einem System gesteuert und müssen von Hand kontrolliert werden, wodurch Nährstoffversorgung und Probennahme variabilitätsanfällig sind. Im Vergleich zu einem Scale-up-Verfahren resultiert die Verwendung von Schüttelkolben nicht selten in unterschiedlichen Zellwachstumsraten und in verschiedenen Protein-Expressionsprofilen.

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Für die Zelllinien-Bewertung müssen gegenwärtig mehrere Durchläufe von Batch- und Fed-Batch-Schüttelkolbenstudien erfolgen, um die anfangs hohe Klonzahl auf eine übersichtlichere Anzahl an Kandidaten zur Evaluierung in Benchtop-Bioreaktoren zu reduzieren.

Diese Methoden sind ressourcenintensiv und aufgrund des hohen Aufwands, anfallender Kosten sowie eines begrenzten Durchsatzes kann nur eine beschränkte Anzahl an Benchtop-Bioreaktoren parallel betrieben werden. Gewöhnlich kommt nur eine sehr geringe Anzahl von Zelllinien in kleinen Gefäßen (2 bis 10 l) zur Evaluierung. Die letztlich selektierte Zelllinie kann beim Scale-up durch suboptimale Leistung Ergebnisse wie Ausbeute und Produktqualität beeinträchtigen.

Die Notwendigkeit, unter „realen“ Benchtop-Bioreaktorbedingungen zahlreiche Experimente durchzuführen, hat zur Entwicklung von miniaturisierten Technologien geführt, die einen hohen Durchsatz an Zellkulturen ermöglichen. Viele dieser Ansätze haben jedoch den Nachteil, dass sie die tatsächliche Strömungs- und Rührwirkung eines Bioreaktors nicht nachahmen, da sie über kein internes Rührwerk verfügen und das Mischen stattdessen durch andere Methoden wie z.B. Schütteln erfolgen muss.

Automatischer Microbioreaktor mit Begasung und Rührwerk

Um das Mischen und die Gasparameter im Bioreaktor nachzuahmen, hat das britische Unternehmen TAP Biosystems (seit Dezember 2013 Sartorius Stedim Biotech zugehörig) das innovative Microbioreaktorsystem ambr15 entwickelt. Das System besteht im Wesentlichen aus drei Komponenten: Einwegbioreaktor, Workstation und Software. Das System ermöglicht die automatische parallele Verarbeitung und Steuerung von 24 oder 48 Bioreaktorexperimenten durch nur einen Mitarbeiter und ist für Säugetier- und Insektenzellen geeignet. Das System ist mit einem Rührwerk und einer Gaszufuhr ausgestattet. Es ahmt das Funktionsprinzip von Benchtop-Bioreaktoren nach und ermöglicht somit eine deutlich bessere Kontrolle über Umfeld und Verfahren. Infolgedessen liefert diese Technologie weitaus repräsentativere Aussagen über die Entwicklung von Zellkulturen als etwa die Verwendung von Schüttelkolben.

Die ambr15-Workstation für die komplette Steuerung

Die ambr15-Workstation steuert 24 oder 48 Einweg-Microbioreaktoren mit einem Arbeitsvolumen von jeweils 10 bis 15 ml. Sie müssen – anders als konventionelle Kulturgefäße aus Glas – nach Gebrauch nicht gereinigt und sterilisiert werden. Zur Wahrung der Sterilität befindet sich der ambr-Arbeitsplatz in einer biologischen Sicherheitswerkbank. Durch die automatische Liquid-Handhabung werden Anlegen von Kulturen, Inokulation, Versorgung mit Nährstoffen und Pipettenspitzen-Sedimentierung sowie Probenahmen in Gefäßen wie 24/96-Well-Platten und Vicell-Behältern unter aseptischen Bedingungen ermöglicht. Betriebsprotokolle können für eine individuelle Kontrolle von maximal 24 oder 48 parallel betriebenen Reaktoren konfiguriert werden. Jeder Bioreaktor enthält individuelle Messzellen für gelösten Sauerstoff (DO) oder pH-Sensoren für die Regelung dieser Parameter. Eine automatisierte pH-Regulierung erfolgt durch CO2-Begasung oder eine Alkalizugabe. Mit Sauerstoff wird begast, wenn ein DO-Sollwert aufrecht erhalten werden muss. Für die präzise Kulturkontrolle kann ein Analysemodell an die Workstation zur Atline-pH-Kalibrierung angeschlossen werden. Das System basiert auf einer Software, mit deren Hilfe der Anwender ein Protokoll mit den Schritten einrichtet, die vom ambr-System abzuarbeiten sind. Das Protokoll definiert Betriebsparameter wie DO-/pH-Sollwerte, Rührgeschwindigkeit und Temperatur.

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Protokollzeiten und -daten können jederzeit beliebig bearbeitet werden, wenn Schritte hinzugefügt, geändert und gelöscht werden sollen – auch während der Versuche selbst. Echtzeitdaten wie Gasflussraten, Volumen, pH-/DO-Werte werden während eines Laufs kontinuierlich gespeichert, externe Werte wie Zellzahl, Metaboliten und Impfstofftiter können ebenfalls in das Programm importiert werden. Daten lassen sich innerhalb der Software grafisch darstellen oder zur Ergebnisdarstellung in Diagramme oder Tabellen in Kalkulationsprogramme exportieren. Keine dieser Automatisierungsfunktionen ist für Schüttelkolbenmethoden verfügbar. Die Automatisierung bietet eine einheitliche Vorgehensweise und ermöglicht den Forschern, sich auf wesentliche Aufgaben wie die Analyse der Daten und Planung zukünftiger Experimente zu konzentrieren, anstatt wertvolle Zeit für repetitive Laborarbeiten aufzuwenden.

Die Zukunft des Zelllinien-Screenings

Mit dem ambr15-Microbioreaktorsystem mit Rührwerk können im Vergleich zu Schüttelkolbenmethoden oder konventionellen Benchtop-Reaktoren signifikante Zeitgewinne und Kostenreduktion bei Vorbereitung, Betrieb, Abbau, Reinigung und Sterilisierung erzielt werden. Da diese Miniatursysteme komplett automatisiert sind und kleinere Zellkulturvolumen erfordern, können mit der gleichen Menge an Ressourcen wie beispielsweise Medien oder Zellnahrung wesentlich mehr Experimente durchgeführt werden. Daher ist dies eine kostenwirksame Hochdurchsatzmethode zur Auswahl hoch effizient exprimierender Zelllinien und Optimierung des Zellkultivierungsprozesses. Folglich wird die Bioprozessoptimierung nicht mehr durch die Verfügbarkeit von Benchtop-Bioreaktoren, Arbeitszeit und Infrastruktur des Labors begrenzt. Der Einsatz der ambr15-Microscale-Technologie kann erheblich dazu beitragen, Entwicklungszeiten zu verkürzen und die Herstellungskosten proteinbasierter Therapeutika zu senken.

* M. McAdam, D. Grone: Sartorius Stedim Biotech, 37079 Göttingen

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