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Intelligent automatisieren Mikroskopie: In sechs Schritten zum automatisierten Scannen von Slides

Autor / Redakteur: Dr. Horst Wolff* und Dr. Laurent Gelman** / Dr. Ilka Ottleben

Obwohl die Mikroskopie viele Neuerungen im Hinblick auf Kontrast, Beleuchtung, Auflösung, Signalerfassung und Datenverarbeitung erfahren hat, begrenzt der Faktor Mensch häufig die Anzahl und Qualität der Forschungsergebnisse. Automatisierungslösungen sind daher gefragt.

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Zeiss Celldiscoverer 7 ist ein vollständig integriertes und automatisiertes High-End-System für Live Cell Imaging.
Zeiss Celldiscoverer 7 ist ein vollständig integriertes und automatisiertes High-End-System für Live Cell Imaging.
(Bild: Carl Zeiss Microscopy)

Mitte der 1990er-Jahre entwickelten sich Mikroskope zu so genannten Imaging-Systemen, bei denen hauptsächlich analoge Kameras durch digitale ersetzt, Komponenten schrittweise motorisiert und Fortschritte bei der Softwaresteuerung von Komponenten und Detektoren/Kameras gemacht wurden. Während der vergangenen ein bis zwei Jahrzehnte kamen erweiterte Verarbeitungs- und Speicherlösungen sowie die Integration von Robotern häufig zu motorisierten Mikroskopen hinzu, um Durchsatz und Effizienz von Imaging-Systemen weiter zu steigern. Diese Imaging-Systeme ersparen Wissenschaftlern Arbeits- und Zeitaufwand und verbessern die Qualität und Präzision sowie nicht zuletzt die Reproduzierbarkeit von Imaging-Experimenten.

Automatisiertes Imaging?

Aber gilt ein so genanntes vollautomatisches Imaging-System wirklich als solches, wenn es nach wie vor viele Interaktionspunkte mit dem Menschen gibt? Bei der Einrichtung und Durchführung von Experimenten ist häufig immer noch der Bediener erforderlich und es wird viel Zeit in die Erfassung, Verarbeitung, Analyse und den Export von Bildern und Daten investiert, welche die Forschungs- und Publikationsnormen erfüllen. Insbesondere diese typischen Workflow-Schritte erfordern jedoch einen hohen Automatisierungsgrad, damit der Bediener in geeigneter Weise unterstützt wird.

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Ein Beispiel für die gelungene Umsetzung von vielen dieser Funktionen ist das System Zeiss Celldiscoverer 7, das mithilfe der ZEN Imaging Software vollständig gesteuert wird und über diverse Automatisierungsfunktionen verfügt, die es zu einem echten automatisierten System machen. Auch für den Zeiss Axio Observer hat das Unternehmen kürzlich verschiedene Automatisierungsfunktionen über die Imaging-Softwareumgebung Zeiss ZEN integriert. Aus den zahlreichen Workflows beispielhaft herausgegriffen, wird im folgenden ein automatisierter Workflow für das Scannen von Slides vorgestellt, der am Baseler Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research entwickelt wurde. Dieser wurde auf dem ersten automatisierten Imaging-System entwickelt, dass Zeiss im Jahr 2012 in den Markt eingeführt hat, dem Slidescanner Axio Scan.Z1.

Slides automatisch scannen

Die Herausforderung des Scannens von Slides ist das Management – das Benennen und Sortieren der Hunderten von Dateien, die erzeugt werden sowie ihre Verarbeitung, Visualisierung, Übertragung, Speicherung und Analyse. Um Verwechslungen zwischen den Slides und Dateien, lange Vervielfältigungszeiten der Dateien und Verlust oder doppelte Erstellung von Daten zu vermeiden, wurde ein weitgehend automatisierter Arbeitsablauf entwickelt. Dieser reicht von der histologischen Färbung bis zur Bildverarbeitung und umfasst folgende Schritte:

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Interview mit dem Autor Dr. Horst Wolff zum Thema automatisierte Mikroskopie

LP: Herr Dr. Wolff, inwiefern hat sich die Mikroskopie im Bereich Biowissenschaften im Laufe der Jahre verändert?

Dr. Horst Wolff: Als Carl Zeiss vor mehr als 170 Jahren mit der Produktion von Mikroskopen begann, drehte sich alles um das Mikroskopstativ und die Optiken. Diese Gesichtspunkte sind nach wie vor entscheidend, wenn es darum geht, ausgezeichnete Ergebnisse zu erhalten. Allerdings rücken bei der heutigen modernen Datenerfassung im Bereich Biowissenschaften noch weitere Aspekte in den Fokus. Durch den Einsatz von Digitalkameras, einen hohen Motorisierungsgrad und erweiterte Softwaresteuerung von Komponenten und Detektoren/Kameras sind Mikroskope zu komplexen Instrumenten geworden. Die Fortschritte in der Datenverarbeitung und Datenspeicherung sowie die Integration von Robotern haben der Leistung und Effizienz bildgebender Systeme weitere Impulse verliehen.

LP: Worin besteht der Nutzen vollautomatisierter Systeme?

Dr. Wolff: Der größte Vorteil der Automatisierung ist die Arbeitsersparnis. Forscher müssen einfach weniger Zeit vor dem Gerät verbringen und profitieren gleichzeitig von einem höheren Probendurchsatz und einer besseren Datenqualität. Darüber hinaus können durch Automatisierung häufig auch Energie und Werkstoffe eingespart und die Genauigkeit, Reproduzierbarkeit, Qualität und Präzision verbessert werden. Diese Vorteile wirken sich auf alle Bereiche der biomedizinischen Bildgebung aus und beschränken sich nicht auf klinische und diagnostische Arbeitsabläufe.

LP: Wie kann die Automatisierung konkret helfen?

Dr. Wolff: Stellen Sie sich vor, Sie haben Ihr Imaging-System eingerichtet, um Ihre kostbaren Proben zu beobachten, manuell Screens ausgeführt und eine Position auf dem Probenträger ausgewählt, die Erfolg-versprechend scheint. Die Begeisterung am nächsten Morgen, nachdem Sie die Ergebnisse der Übernacht-Zeitreihe geprüft haben, hält sich allerdings in Grenzen – keine der ausgewählten Positionen brachte brauchbare Ergebnisse hervor. In einigen Fällen sind die interessierenden Zellen nach einigen Stunden einfach abgestorben, andere sind aufgrund einer ungewöhnlich hohen Zellmotilität aus dem Sehfeld gewandert. In wieder anderen Fällen hat das System nur Zellbruchstücke und nicht die interessierenden Objekte selbst fokussiert. Nahezu alle Forscher kennen diese Probleme und obwohl der Durchsatz von Experimenten durch Motorisierung im letzten Jahrzehnt gesteigert werden konnte, sind die Erwartungen und Standards für Publikationen im gleichen Zeitraum sogar noch stärker gewachsen. Die Lösung dieses Problems und zahlreicher anderer Probleme besteht nicht darin, neben dem Mikroskop zu schlafen oder noch schnellere bildgebende Instrumente zur Erfassung von immer mehr Objekten zu verwenden. Es wird Zeit für eine intelligente Automatisierung, die nicht nur riesige Datenmengen erzeugen kann, sondern auch exakt die Daten, die der Anwender benötigt.

LP: Welche Lösungen bietet Zeiss? Was unterscheidet Sie von anderen Angeboten?

Dr. Wolff: Wir haben vor Kurzem verschiedene Automatisierungsfunktionen für Zeiss Axio Observer, unsere bewährte inverse Mikroskop-Plattform, auf den Markt gebracht. Alle Funktionen des Mikroskops, wie die nächste Generation des hardwarebasierten Autofokus, innovative Fluoreszenzfilter-Wechsler oder die automatisierten Objektiv-Korrekturringe, sind nahtlos in die ZEN Imaging Software integriert. Damit bieten wir eine äußert kostengünstige und wirksame Möglichkeit zur Verbesserung der Produktivität und der Qualität der Ergebnisse. Für alle, die ein automatisiertes Komplettsystem für das Live Cell Imaging suchen, bieten wir Zeiss Celldiscoverer 7, die nächste Generation des automatisierten Imaging-Systems, an. Das Gerät kann die Art des Probenträgers erkennen, die Bodenart und -dicke messen und den Probenträger kalibrieren. Der Benutzer muss nicht mit dem System interagieren, da alle Schritte automatisch ausgeführt werden. Der Forscher spart so bei jedem Einlegen einer neuen Probe wertvolle Minuten oder gar Stunden. Celldiscoverer 7 zeigt, welche Ergebnisse mit einer nahtlosen Integration aller motorisierten Komponenten, Sensoren und Eingabegeräte in eine Softwareumgebung im Rahmen der Automatisierung erzielt werden können. Die Vorschau- oder Übersichtskamera, ein hardwarebasierter Autofokus und automatisch einstellbare Optiken bringen einen besonders hohen Nutzen. Ein integriertes Barcode-Lesegerät kann sich als extrem praktisch erweisen, wenn in der Laborumgebung Barcodes verwendet werden. Die ZEN Imaging Software ZEN von Zeiss verfügt über vordefinierte Konfigurationen sowie umfassend dokumentierte Schnittstellen, um die Einbindung von Programmen und Algorithmen zu erlauben, die notwendig sind, um mit neuesten wissenschaftlichen Entwicklungen Schritt halten zu können. Was für Software gilt, trifft auch auf die Hardware zu: Schnittstellen, die mit der neuesten Hardware und dem Zubehör zusammenarbeiten, z.B. Triggeraus- und -eingänge und gut dokumentierte optische Anschlüsse, tragen zu einer nahtloseren und erfolgreicheren Automatisierung bei.

LP: Was ist als Nächstes geplant? Wie werden bildgebende Verfahren in Zukunft aussehen?

Dr. Wolff: Automatisierung fängt nicht beim Imaging-System an – und hört dort längst nicht auf. Die Herausforderungen für Forscher, die Untersuchungen mit bildgebenden Verfahren durchführen, sind vergleichbar mit den Herausforderungen anderer Arbeitsabläufe im Labor. Durch die steigenden Standards in Sachen Dokumentation und Reproduzierbarkeit, noch zahlreichere interdisziplinäre Forschungsvorhaben und die Weiterführung kurzfristiger Forschungsverträge wird die Automatisierung auch für kleinere Labors attraktiv und erschwinglich. Mit dem technologischen Fortschritt wird die Automatisierung in vielen Bereichen unentbehrlich. Neue Technologien wie Smart Connected Products und das Internet der Dinge haben das Potenzial, die heutige Bildgebung im Forschungsbereich komplett zu revolutionieren. Die Mikroskopie-Produkte von Zeiss sind für diese Entwicklung gewappnet.

  • Schritt 1: Der Nutzer beschreibt innerhalb des Projekts in der Bild-Datenbank jedes Slide, das gescannt werden soll, in einem getrennten Unterordner, mit der relevanten Information für die Einfärbung der Probe (z.B. Antikörper-Typen und Verdünnungen, Puffer). Diese Informationen werden durch die Mitarbeiter des Histologie-Labors verwendet, um den Roboter für die Färbung der Aufnahme zu programmieren. Nach Abschluss des Färbens erzeugt das im vorliegenden Fall verwendete Ventana-System ein Protokoll, erstellt einen Bericht und die Mitarbeiter importieren diese Dateien in die Bild-Datenbank des Nutzerprojekts.
  • Schritt 2: Der Nutzer lädt die Slides in den Scanner. Um das langwierige und fehleranfällige Benennen jedes einzelnen Slides zu vermeiden, steuert die Software den Scanner (ZEN 2.0 bzw. Axio Scan.Z1 von Zeiss). Ein Skript wurde in-house entwickelt, um die Namen der Experimente aus der Bild-Datenbank in eine XLS-Datei zu exportieren, die direkt in die Scanner-Software importiert werden kann. Ein eindeutiges Tag wird dem Experiment-Namen sowohl in der Datenbank als auch beim Export hinzugefügt, um das Slide zu identifizieren. Jedes Slide kann dann auf seinem Weg in die Histologie und zurück zum Scannen und Archivieren der Bilder ohne Verwechslung rückverfolgt werden.
  • Schritt 3: Die Slides werden automatisch gescannt und die Bilder lokal auf Festplatten gespeichert (4 TB Kapazität). Ein Robocopy-Skript spiegelt diesen Daten-Ordner automatisch auf einem Server, der durch eine 10-GB-Verbindung verbunden ist.
  • Schritt 4: Ein selbst erstelltes Skript in der Bild-Datenbank sucht regelmäßig nach neuen Dateien auf diesem Server. Wenn der Name einer Datei mit dem eines Experiments auf diesem Server übereinstimmt, wird eine kleine Abbildung des Etiketts des Slides und der Link zur Datei selbst auf dem Server der Datenbank hinzugefügt.
  • Schritt 5: Der Nutzer kann die Bilder nochmals durchsehen, und zwar von jedem beliebigen Computer aus der Einrichtung oder auf virtuellen Geräten, auf die durch Desktop-Verbindungen aus der Ferne zugegriffen wird. Alle werden mit dem Server durch ein fest zugeordnetes 10-GB-Netzwerk verbunden.
  • Schritt 6: Will der Nutzer ein Bild langfristig archivieren, dann zeigt die Maske für das Experiment in der Bild-Datenbank eine kleine Schaltfläche, die, wenn sie ausgewählt wird, jede Nacht eine Kopie der Dateien vom Server in das Archivsystem des Instituts auslöst, welches aus Laufwerken und Bändern mit einer maximalen Kapazität von 8 PT besteht. Es werden drei redundante Kopien der Daten erstellt. Durch den zusätzlichen Schritt „klicken für das Archivieren“ wird das automatische Importieren von nicht erfolgreichen Experimenten in die Bild-Datenbank vermieden.

* Dr. H. Wolff: Carl Zeiss Microscopy GmbH, 07745 Jena

* *Dr. L. Gelman: Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, 4058 Basel

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