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Antibiotikarückstände Minilabor weist Antibiotikarückstände in Milch nach

Autor / Redakteur: Michael Seidel*, Klaus Wutz*, Reinhard Nießner*, Richard Dietrich**, Erwin Märtlbauer**, Katrin Klot / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Schnell, sicher und preiswert sollen Testsysteme für die Rückstandsanalytik sein – drei wichtige Kriterien, die sich nur selten miteinander vereinbaren lassen. Die Mikroarray-Technologie in Verbindung mit einem Multianalyt-Immunoassay meistert diese Kriterien. Wissenschaftler der Technischen Universität München (TUM) entwickelten zusammen mit Kooperationspartnern aus der Ludwig-Maximilian-Universität (LMU) und der GWK Präzisionstechnik ein vollautomatisiertes Minilabor zum schnellen und sicheren Nachweis von Antibiotikarückständen in Milch.

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Abb. 1: Das Minilabor im Praxiseinsatz beim Milchprüfring Bayern (MPR) in Wolnzach.
Abb. 1: Das Minilabor im Praxiseinsatz beim Milchprüfring Bayern (MPR) in Wolnzach.
( Bild: Baumgartner/MPR Wolnzach, Ausschnitt )

Der Einsatz von Antibiotika bei Milchkühen ist unerwünscht, lässt sich jedoch nicht immer vermeiden – auch nicht in der ökologischen Landwirtschaft. Rückstände von antimikrobiellen Substanzen in Milch stellen für den Verbraucher ein gesundheitliches Risiko dar und verursachen deshalb hohe wirtschaftliche Schäden durch Produktionsausfälle und Entsorgungskosten in der Milch- und Lebensmittelwirtschaft. Insgesamt entsteht der europäischen Milchwirtschaft dabei ein Schaden von jährlich mehr als 200 Millionen Euro. Die Europäische Union hat zum Schutz der Verbraucher Grenzwerte erlassen, doch bislang ist der Nachweis aller verfügbaren antimikrobiell-wirksamen Medikamente in der Milch aufwändig und lückenhaft.

Um Risiken und Schäden zu vermeiden, wird bislang die Anlieferungsmilch in den Molkereien kontrolliert und zusätzlich im Rahmen der Milchgüteuntersuchung in neutralen Prüflaboren überprüft. Hierzu wird ein mikrobiologischer Hemmstofftest eingesetzt. Hemmt die Milchprobe das Wachstum von Prüfbakterien, so besteht ein Anfangsverdacht auf Antibiotikarückstände, dem mit aufwändigeren Analysen weiter nachgegangen wird. Nachteil des Verfahrens: Es dauert bis zu drei Stunden und es ist keine exakte Identifizierung und Quantifizierung der Wirkstoffe möglich. Rezeptor-Schnelltests sind zwar vorhanden, benötigen jedoch eine Reihe manueller Arbeitsschritte und erlauben nur den Nachweis einzelner Antibiotika-Gruppen.

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Mikroarray-basiertes Testsystem für die Multiplex-Analytik

Ideal wäre eine vorgelagerte Erfassung möglichst vieler Arzneimittelrückstände beim Erzeuger oder bei der Eingangskontrolle der Molkereien. Mit diesem Ziel vor Augen entwickelten Wissenschaftler des Lehrstuhls für Analytische Chemie der Technischen Universität München (TUM) und des Lehrstuhls für Hygiene und Technologie der Milch an der Ludwig-Maximilians-Universität München einen Glas-Chip und eine vollautomatische Analysenplattform, die Rückstände der 14 wichtigsten Antibiotika parallel und sicher nachweisen kann. Dafür nutzen die Wissenschaftler eine Antigen/Antikörper-Reaktion: Auf die Glasplatte sind viele Spots mit den unterschiedlichen Antibiotika aufgedruckt, ein so genanntes Mikroarray. In die zu untersuchende Milchprobe wird ein Cocktail aus spezifisch auf diese Antibiotika reagierenden Antikörpern gemischt. Ist ein Antibiotikum in der Milch, so reagiert dieses mit dem jeweiligen Antikörper.

Je höher die Konzentration des Antibiotikums desto mehr Antikörper sind mit dem Analyten belegt. Die restlichen unbelegten Antikörper binden an die Antibiotikapunkte auf der Platte. Ein zweiter Antikörper bindet an alle am Chip gebundenen Detektionsantikörper. Dieser Sekundärantikörper ist mit dem Enzym Meerrettich-Peroxidase markiert, welches bei Anwesenheit von Luminol und Wasserstoffperoxid eine Chemilumineszenzreaktion an jedem einzelnen Spot auslöst. Durch diese chemische Lichtreaktion, wie sie im Prinzip auch in der Kriminalistik zum Nachweis von Blutspuren verwendet wird, leuchten danach die Punkte am hellsten auf, an denen die meisten Antikörper gebunden sind. War ein Antibiotikum in der Milch, stehen weniger Antikörper zur Verfügung und der entsprechende Punkt erscheint dunkler (s. Abb. 2). Mit einer CCD-Kamera wird die Leuchtintensität gemessen und liefert so nicht nur den Nachweis, ob ein Antibiotikum in der Milchprobe enthalten ist, sondern auch wieviel davon. Die Besonderheit der Multiplex-Analytik ist nun, auch die Quantität von mehreren Antibiotika in einer Milchprobe zu bestimmen; damit kann auf das eingesetzte Medikament zurückgeschlossen werden. Zukünftig kann somit unter Umständen der Verursacher einer Kontamination lückenlos identifiziert und haftbar gemacht werden.

Analysenplattform als vollautomatisches Minilabor

Zusammen mit dem Münchener Unternehmen GWK Präzisionstechnik entwickelten die Wissenschaftler der TUM das vollautomatische Minilabor MCR 3 (Munich Chip Reader 3. Generation), das zusammen mit dem Mikroarray präzise ermittelt, ob die Grenzwerte in der Rohmilch überschritten sind. Die selektiven monoklonalen Antikörper gegen Antibiotika wurden an der LMU entwickelt. Die gesamte Analysenplattform besteht aus einer Fluidik mit Pumpen und Ventilen zur präzisen Steuerung des Messablaufes, einem mikrofluidischen Chip, der den Antibiotika-Mikroarray enthält und die Fluidik verbindet, einem Detektormodul, einer automatischen Probenaufnahmeeinheit und einer integrierten Software zur Prozesssteuerung und analytischen Auswertung der Mikroarray-Bilder. Mit diesem System erhält man ohne Probenvorbereitung der Rohmilch innerhalb von fünf Minuten eine quantitative Information über 14 Antibiotika. Eine weitere Besonderheit des Antibiotika-Mikroarrays ist seine Regenerierbarkeit. Durch einen speziellen Puffer wird die Antikörperbindung an der Oberfläche gelöst und der Antibiotika-Chip steht für eine nächste Analyse bereit. Die Regenerierung lässt sich über 50 Mal wiederholen, sodass eine interne Kalibrierung jedes einzelnen Mikroarray-Chips und die nachfolgende Milchanalyse von bis zu 50 Proben innerhalb eines Messtages möglich sind, ohne den Chip zu wechseln. Dies führt zu einer hohen Präzision und mindert die Kosten pro Analyse. Damit ist das Minilabor weltweit das schnellste und kostengünstigste Messsystem für Antibiotika in Milch.

Die Präzision der Analysen wird durch Multianalyt-Kalibrierstandards noch weiter erhöht, die in Milch lyophilisiert sind. Hergestellt durch das Münchener Unternehmen AiM wurden diese Standards erstmals am MCR 3 für Validierungsuntersuchungen mit Realproben eingesetzt. Diese Untersuchungen fanden beim Milchprüfring Bayern (MPR) statt. Als komplementäre Referenzanalytik wurde bei der Muva in Kempten für jede einzelne Antibiotika-Gruppe eine Extraktions- und Massenspektrometrie-Methode etabliert. Die Validierungsarbeiten wurden über das Bayerische Staatsministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Forsten vom Sondervermögen der Bayerischen Milchwirtschaft finanziert.

Aktuell können die 14 wichtigsten Antibiotika aus den Gruppen der β-Lactame, Sulfonamide, Chinolone, Makrolide und Aminoglykoside innerhalb von fünf Minuten simultan quantifiziert werden (s. Abb. 3). Jeder einzelne Immunoassay wurde soweit optimiert, dass die gesetzlich definierten maximalen Rückstandsmengen (maximum residue level, MRL) möglichst im Arbeitsbereich einer Messkurve liegen (s. Tabelle 1). Ein Teil der Antikörper zeigt eine so hohe Sensitivität, dass im Falle eines positiven Resultats eine Nachbestimmung mit einer verdünnten Probe notwendig ist. Die Inter-Assay-Varianz der Antibiotika-Mikroarrays liegt bei ca. 30 Prozent, die Intra-Assay-Varianz eines Chips hingegen lediglich bei zehn Prozent. Dies bedeutet, dass jeder Chip vor der Messung mit Multianalyt-Standards kalibriert werden muss, um eine hohe Reproduzierbarkeit der Messergebnisse zu erlangen.

Simultane Quantifizierung der 14 wichtigsten Antibiotika

Seit Oktober 2008 wurden am MPR 2408 Hemmstoff-positive Milchproben mit dem MCR 3 analysiert. Davon stimmten 93 Prozent der Realproben mit dem BRT-Test überein und gaben zusätzliche Informationen über die Quantität der 14 aktuell detektierbaren Antibiotika in Rohmilch. Es wurden Rückstände an einzelnen Antibiotika wie Ampicillin, Cloxacillin oder Penicillin G gefunden, aber auch Mischpräparate wie Penicillin G/Streptomycin, Cloxacillin/Ampicillin oder Penicillin G/Neomycin B sind identifiziert worden. Penicillin G war mit 72 Prozent das am häufigsten eingesetzte Antibiotikum.

Tabelle 2 zeigt repräsentative Ergebnisse der Referenzanalytik im Vergleich zum MCR 3. Als komplementäre Analysentechniken wurden beim MPR der BRT-Hemmstofftest durchgeführt und bei der Muva die HPLC-MS-Messungen. Es ist eindeutig zu sehen, dass die Messungen im Multianalyt-Immunoassay sehr gut mit dem Hemmstofftest und der Massenspektrometrie übereinstimmen.

Besserer Verbraucherschutz und Vermeidung von Produktionsausfällen

Das hochpräzise Schnell-Analysesystem wird helfen, Antibiotika-Rückstände in Milchproben zu vermeiden, sowie den verursachenden Milcherzeuger und die Kontaminationsursache frühzeitig zu identifizieren. Bei Einsatz von Antibiotika-Kombinationspräparaten bei der Behandlung der Milchkuh ist es sogar möglich, Rückschlüsse auf das eingesetzte Präparat zu ziehen. Damit werden Produktionsausfälle und erhebliche Entsorgungskosten vermieden und der Verbraucher wird von einer noch weiter verbesserten Sicherheit des Lebensmittels Milch profitieren. Die Entwicklungen des Minilabors wurden von der Bayerischen Forschungsstiftung, dem Bayerischen Staatsministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Forsten, dem Forschungskreis der Ernährungsindustrie (FEI) über AIF-Zutech, dem BMBF, der Bundeswehr und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) finanziell unterstützt.

Literatur

[1] Kloth, K.; Rye-Johnsen, M.; Didier, A.; Dietrich, R.; Märtlbauer E.; Niessner, R.; Seidel, M., A regenerable immunochip for the rapid determination of 13 different antibiotics in raw milk. The Analyst 2009, 134, 1433 - 1439.

[2] Kloth, K.; Niessner, R.; Seidel M., A open stand-alone platform for regenerable automated microarrays. Biosensors & Bioelectronics 2009, 24, 2106-2112.

*Dr. M. Seidel, K. Wutz, Prof. Dr. R. Nießner, Lehrstuhl für Analytische Chemie, TU München, 81377 München,**Dr. R. Dietrich, Prof. Dr. E. Märtlbauer, Lehrstuhl für Hygiene und Technologie der Milch, Ludwig-Maximilians-Universität München, 80539 München,***Dr. K. Kloth, Dr. C. Baumgartner, Milchprüfring Bayern e.V., 85283 Wolnzach,****Dr. T. Westermair, Muva kempten, 87437 Kempten/Allgäu

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