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Filtration Mit Cross-Flow-Filtration größere Volumina aufkonzentrieren

Autor / Redakteur: Noushin Delmdahl* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Die Cross-Flow-Filtrationsanlagen Vivaflow wurden speziell für die Bedürfnisse im Labor konzipiert. Lesen Sie, wie die Systeme die Probenaufbereitung erleichtern.

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1 Mit dem Cross-Flow-System Vivaflow 200 können Proben mit einem Volumen von bis zu fünf Litern verarbeitet werden. (Bilder: Sartorius Stedim Biotech)
1 Mit dem Cross-Flow-System Vivaflow 200 können Proben mit einem Volumen von bis zu fünf Litern verarbeitet werden. (Bilder: Sartorius Stedim Biotech)
( Archiv: Vogel Business Media )

Die Cross-Flow- oder Tangential-Flow-Filtration, zu deutsch Querstromfiltration, ist eine Methode zum Filtrieren oder Konzentrieren von Flüssigkeiten. Sie wird besonders in der Lebensmittel- und Pharmaindustrie angewandt, wenn es um die Filtration bzw. Diafiltration von Proben mit mehreren 1000 Litern Volumen geht. Im Gegensatz zu statischen Filtrationstechniken sind Cross-Flow-Filtrationssysteme in der Lage, Flüssigkeiten mit relativ hohen Trübstoffgehalten zu klären. Dies wird durch eine Querströmung von etwa 2,5 bis 3 m/sec an der Membran erreicht, die die Ablagerung von Trübpartikeln und damit eine rasche Verblockung und Filterkuchenbildung verhindert. Diese industriellen Cross-Flow-Anlagen müssen in Bezug auf Reinigung, Wiederverwendbarkeit und Kontrollierbarkeit sehr hohen Qualitätsstandards gerecht werden. Zahlreiche Normen wie GMP (Good Manufacturing Practice) oder GHP (Good Hygenic Practice) müssen beachtet werden.

Unterschiedliche Filtrationstechniken im Labor verfügbar

Im Labor wird üblicherweise mit sehr viel kleineren Volumina gearbeitet. Für Probenvolumen unter 100 Milliliter bieten sich z.B. Zentrifugationseinheiten für das Konzentrieren und Umpuffern von Proben an. Diese sind als Einwegartikel in vielen Volumenkapazitäten und mit Membranen verschiedener Porengrößen erhältlich (s. Abb. 1). Für Proben über 100 Milliliter stehen Rühr- oder Druckzellen zur Verfügung, die nach einem ähnlichen Fitrationsprinzip wie die Zentrifugaleinheiten arbeiten (Dead-End-Filtration). Bei der Dead-End-Filtration wird die einmal aufkonzentrierte Probe aufgefangen und nicht rezirkuliert wie bei der Cross-Flow-Filtration. Doch auch im Labor können Cross-Flow-Techniken erfolgreich eingesetzt werden. Fallen Probenvolumen von 100 Milliliter bis fünf Liter an, die ebenfalls konzentriert oder umgepuffert werden müssen, z.B. Zellkulturüberstände vor der Aufreinigung, so ist die Querstromfiltration die Technik der Wahl. Diese Volumen sind einerseits zu groß, um mit zentrifugalen oder druckbetriebenen Ultrafiltrationseinheiten konzentriert zu werden, anderseits zu gering für eine industrielle Cross-Flow-Anlage. Dies gilt sowohl in technischer Hinsicht als auch hinsichtlich der mit einer solchen Anlage verbundenen, hohen Kosten.

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Diese Kosten entstehen vor allem durch Anforderungen, die im Labor nicht gefragt sind z.B. GMP-gerechte Herstellung und exaktes Monitoring des Konzentrationsverlaufes. Für solche Fälle bieten sich die Cross-Flow-Einheiten Vivaflow von Sartorius Stedim Biotech an. Gefertigt aus Polycarbonat oder Acryl, bieten sie eine schnelle und einfache Lösung für die Konzentrierung von biologischen Proben bis zu fünf Liter Volumen. Die Einheiten sind nach einem Plug-and-Play-Prinzip zu bedienen: Eingebaute Schläuche zu der Einheit müssen lediglich in den Pumpenkopf einer peristaltischen Pumpe eingehängt werden. Diese fördern dann das Probenvolumen kontinuierlich über die eingesetzte Cross-Flow-Kassette, bis das gewünschte Volumen erreicht wird.

Für die Aufbereitung von Gewässerproben geeignet

Durch ihre einfache Handhabung eignen sich Vivaflow-Kassetten besonders für die Wasseranalytik. Im norwegischen Bergen werden Vivaflow-Einheiten z.B. eingesetzt, um Salmon Amenia Virus (ISAV) in Lachszuchtbecken nachzuweisen [1].

Hierfür werden zwei Liter Wasser aus dem Zuchtbecken mit Vivaflow 200 mit einer Poly-ethersulfon-Membran (100 kDa) auf 80 Milliliter aufkonzentriert. Diese Anreicherungsprozedur ist besonders schonend und in weniger als einer halben Stunde durchzuführen. Anschließend wird die virale RNA aus der aufkonzentrierten Probe extrahiert und mittels Real-Time-PCR nachgewiesen. Virenmengen von nur 5,5 Viren pro Milliliter (Tissue Culture Infectiouns Dose TCID50, antivirale Aktivität 1,6 x 10-2 ml-1) konnten mit dieser Methode erfolgreich nachgewiesen werden.

Auch Bakterien und Phytoplankton aus Gewässerproben können über Vivaflow aufkonzentriert werden. Dies wurde von einem Team um Marjolojn Tijdens [2] mit einer Serie von Wasserproben aus dem Lake Loosdrecht – einem seichten, eutrophischen See in den Niederlanden – durchgeführt. Hier sollte die dynamische Zusammensetzung der Wasserorganismen in Abhängigkeit von der Jahreszeit und das damit zusammenhängende Virusaufkommen in dem See bestimmt werden. Nach der erforderlichen Konzentration von zwei Litern Seewasser um das vierzigfache mit Vivaflow 200 mit einer Polyethersulfon-Membran (30 kDa), wurden die Mikroorganismen mittels Epifluoreszenz-Mikroskopie und Pulsed-Field-Gelelektrophorese (PFGE) nachgewiesen.

Je nach Jahreszeit konnten hier 5,5 x 107 bis 1,3 x 108 virenartige Partikel pro Milliliter detektiert werden. Für diese Applikation eignen sich die Vivaflow-Einheiten besonders gut, da die Probenvorbereitung sehr schnell vor Ort erfolgen musste, um eine exakte Zustandsaufnahme des Gewässers zu garantieren.

Aufreinigung des Glykoproteins Avidin aus Zellkultur-Überstand

Aber auch für die Konzentration von Proteinen aus Medienüberständen eignet sich Vivaflow. Wissenschaftler um Andrea Zocchi von der Universität im schweizerischen Neuchâtel [3] berichten über die Aufreinigung eines rekombinanten, glykolysierten Avidins (recGAvi) aus der Hefe Pichia pastoris. Natives Avidin ist ein Glykoprotein aus Hühnerei, das Biotin (Vitamin H) binden kann und so beispielsweise die Carboxylierung von Pyruvat hemmt. RecGAvi wurde von P. pastori in den Kulturüberstand exprimiert. Vor der Aufreinigung des Proteins wurde der Fermenterüberstand, welcher 330 mg/l recGAvi enthielt, abzentrifugiert und über Viva-flow 200 (30 kDa Polyethersulfon-Membran) auf 50 ml einkonzentriert und dabei gleichzeitig mit einer Pufferlösung (0,05 M NaHCO3 und 0,5 M NaCl) auf pH 9,8 umgepuffert.

Dies ist bei einer Cross-Flow-Applikation ohne weiteres möglich, indem man ein geschlossenes System erzeugt, welches in dem Maße einen neuen Puffer aus einem Reservoir in die konzentrierte Probe zieht, wie Filtrat abgeführt wird. Ein entsprechender Versuchsaufbau ist in Abbildung 2 dargestellt. So kann ein bis zu 99-prozentiger Pufferaustausch erreicht werden. Die aufkonzentrierte und umgepufferte Rec-Avidin-Probe konnte danach mittels Affinitätschromatographie mit 2-Iminobiotin-Agarose aufgereinigt werden.

Cross-Flow-Filtration auch fürs Labor geeignet

Die Cross-Flow-Filtration kann auch im Labor in vielen unterschiedlichen Applikationen gut eingesetzt werden, wie die vorhergehenden Beispiele zeigen. Vor allem, wenn es um die Aufkonzentration bzw. um das Umpuffern von biologischen Proben geht, spielt die Technik ihre aus dem Prozessmaßstab schon bekannten Vorteile aus. Sie erleichtert und beschleunigt das Arbeiten, indem langwierige Zentrifugationsschritte ersetzt werden.

Neuartige Cross-Flow-Systeme wie die Vivaflow von Sartorius Stedim Biotech sind zudem auf die Bedürfnisse im Labormaßstab ausgelegt. Diese Sartorius-Einheit eignet sich damit optimal für das zuverlässige und schnelle Aufarbeiten von Proben mit einem Volumen von bis zu fünf Litern. Mit dem entsprechenden Zubehör wie Spinnerflaschen kann das Filtrationssystem weiterhin individuell auf die benötigten Anwendungen zugeschnitten werden.

[1] Microb Ecol. 2008 July; 56(1): 29–42. Population Dynamics and Diversity of Viruses, Bacteria and Phytoplankton in a Shallow Eutrophic Lake, Marjolijn Tijdens et al. Department of Microbial Wetland Ecology, Centre for Limnology, Netherlands Institute of Ecology

[2] Journal of Plankton Research 2008 30(3):261-273 Microbial dynamics during the decline of a spring diatom bloom in the Northeast Atlantic Carole A. Llewellyn et al. 1 Plymouth Marine Laboratory, Prospect Place, The Hoe, Plymouth PL1-3DH, UK

[3] Protein Expression and Purification 32 (2003) 167–174, Expression and purification of a recombinant avidin with a lowered isoelectric point in Pichia pastoris, Andrea Zocchi et al. Institut de Chimie, Universite de Neuchatel, Av. de Bellevaux 51, CH-2000 Neuchatel, Switzerland ie

*Dr. N. Delmdahl, Senior Produktmanagerin, Sartorius Stedim Biotech, 37070 Göttingen

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