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Photodynamische Therapie Mit Theoretischer Chemie photodynamische Wirkstoffe entwickeln

Autor / Redakteur: Markus Oppel, Juan Jose Nogueira Pérez, Leticia González* / Dr. Ilka Ottleben

Photodynamische Therapie ist eine vielversprechende Alternative zur Behandlung von Krebs und mikrobiellen Infektionen. Durch den Einsatz moderner Methoden der Theoretischen Chemie lässt sich der Mechanismus der Wirkstoffe verstehen und gleichzeitig Vorschläge für neue Wirkstoffe machen.

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Abb. 1: Computersimulationen können helfen, neue Wirkstoffe für die vielversprechende Photodynamische Therapie zu entwickeln.
Abb. 1: Computersimulationen können helfen, neue Wirkstoffe für die vielversprechende Photodynamische Therapie zu entwickeln.
(Bild: © alice_photo - Fotolia)

Viele antimikrobielle Substanzen und Antitumormittel haben als gemeinsames Wirkprinzip das Ziel der Abtötung von Mikroorganismen oder Tumorzellen. Bei der Photodynamischen Therapie, welche vorwiegend in der Dermatologie und Zahnheilkunde, aber auch in der Onkologie eingesetzt wird, wird dem Patienten eine durch Licht aktivierbare Substanz verabreicht. Der Wirkstoff lagert sich in Mikroorganismen beziehungsweise in Tumorzellen ein und wird anschließend bestrahlt. Dabei werden toxische Substanzen freigesetzt, die die Krebszellen oder Mikroorganismen abtöten. Ein großer Vorteil dieser Therapieform ist dabei die lokale Beschränkung und damit eine wesentliche Reduzierung der Nebenwirkungen. Bei der Antitumortherapie ist außerdem keine weiträumige Entfernung von gesundem Gewebe notwendig.

Besonders häufig werden Substanzen (so genannte Photosensibilisatoren) eingesetzt, welche nach Bestrahlung reaktiven Singulettsauerstoff freisetzen, der die Zellen abtötet. Die Bandbreite der dabei verwendeten Verbindungen reicht von Porphyrinen über Chlorophylle bis hin zu Farbstoffen. Insbesondere Phenothiazinfarbstoffe wie Methylenblau, Toluidinblau oder Nilblau sowie deren Derivate sind in den letzten Jahren in den Mittelpunkt der Forschung gerückt.

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Bei der Auswahl der richtigen Substanz spielen neben Faktoren wie Pharmakokinetik und Toxizität die Wellenlänge des einzusetzenden Lichts, die Effizienz der Sauerstofffreisetzung (Quantenausbeute) sowie die Lokalisierung der Verbindung im Organismus eine entscheidende Rolle. Insbesondere Letzteres bestimmt nicht nur die Art und Weise, wie die (Tumor-)Zellen abgetötet werden. Untersuchungen haben gezeigt dass Singulettsauerstoff in der Zelle nur eine Lebensdauer von ungefähr 3 µs hat. Der Photosensibilisator muss sich also innerhalb der Zelle in großer Nähe zu den vorhandenen Biomolekülen befinden, um seine zerstörende Wirkung zu entfalten.

Unterstützung durch die Theoretische Chemie

Fragestellungen, bei deren Aufkärung Simulationen und Modellierung mit Methoden der Theoretischen Chemie wesentliche Beiträge leisten können sind hierbei: Wie bindet der Photosensibilisator an das Biomolekül innerhalb der Zelle? Wie und wie effizient wird der Singulettsauerstoff erzeugt? Weiterhin interessant ist natürlich auch die Frage: Wie kommt der Wirkstoff in die Zelle und insbesondere wie effizient durchdringt er die Zellmembran.

Speziell von Phenothiazinfarbstoffen wird vermutet, dass sie sich an DNA anlagern. Vom oben erwähnten Methylenblau und anderen Phenothiazinderivaten ist bekannt, dass sie hauptsächlich in die Mitochondrien eindringen und vermutlich mit der mitochondralen DNA wechselwirken. Es liegt also die Vermutung nahe, dass nach Aktivierung durch Licht und Freisetzen des reaktiven Sauerstoffs die DNA zerstört wird und dadurch die (Tumor-)Zellen abgetötet werden.

Ein wichtige Fragestellung ist hierbei, wie genau der Farbstoff an die DNA bindet und ob das Andocken an die Erbsubstanz einen Einfluss auf den Mechanismus der Singulettsauerstofferzeugung hat.

Moleküldynamik mithilfe von Simulationen untersuchen

Die Frage nach der Art der Bindung an die DNA lässt sich am besten mithilfe von Moleküldynamiksimulationen beantworten. Hierbei wird sowohl die Bewegung (über die kinetische Energie) als auch die Wechselwirkung der Atome eines Moleküls bzw. eines Molekülaggregats miteinander mittels klassischer Mechanik beschrieben. Auf modernen Computerarchitekturen (so genannte Cluster) lassen sich hierbei routinemäßig Systeme mit mehreren 10 000 Atomen simulieren, wobei auch das Lösungsmittel (z.B. Wasser) also auch eventuell darin gelöste Salze (z.B. Na+/Cl--Ionenpaare) berücksichtigt werden können, um physiologischen Bedingungen zu simulieren.

Von Methylenblau sind verschiedene Bindungsmodi an die DNA bekannt. Neben einer seitlichen Anlagerung ist die Einlagerung in die große bzw. kleine Furche experimentell beobachtet worden. Ein vierter beobachteter Bindungsmodus ist die direkte Interkalation zwischen den Nukleinbasen, wobei der Farbstoff parallel zu den Watson-Crick-Paaren ausgerichtet ist. Moleküldynamiksimulation sagen nun diese Art der Bindung als die bei weitem stabilste voraus. Die Einlagerung in die kleine Furche sollte zu einem geringen Anteil auch beobachtbar sein, während die Einlagerung in die große Furche und die seitliche Anlagerung nicht stabil sind und deshalb auch nicht auftreten dürften.

Lagert sich nun das Farbstoffmolekül direkt zwischen die Nukleinbasen ein, so sollte dies einen direkten Einfluss auf den Mechanismus der Singulettsauerstofferzeugung haben. Die Art und Weise, wie Methylenblau die durch Lichtanregung gewonnene Energie auf die Sauerstoffmoleküle der Umgebung überträgt, hängt wesentlich davon ab, ob der Farbstoff in Wasser gelöst ist oder ob er sich in der Gasphase ohne jegliche Wechselwirkung mit der Umgebung befindet. In wässriger Lösung bildet Methylenblau Wasserstoffbrücken zum Lösungsmittel aus. Dadurch werden die Triplettzustände des Moleküls, also diejenigen elektronisch angeregten Zustände mit zwei ungepaarten Elektronen, energetisch zu höheren Energien verschoben. Da die Energieübertragung vom Farbstoffmolekül auf den Sauerstoff der Umgebung nur von Triplettzuständen aus möglich ist, sollte Methylenblau, welches Wasserstoffbrücken zu benachbarten Molekülen ausgebildet hat, eine geringere Effizient bezüglich der Singulettsauerstofferzeugung zeigen. (Scheinbar widersprüchlich zeigt Methylenblau in wässriger Lösung eine starke Singulettsauerstofferzeugung. Dies ist aber auf einen anderen Mechanismus zurückzuführen, der in DNA-Umgebung keine wesentliche Rolle spielt).

Die Frage ist nun: Was passiert, wenn Methylenblau direkt zwischen die Basenpaare der DNA eingelagert ist? Von einer Vielzahl von Untersuchungen weiß man, dass innerhalb der DNA nur wenige Wassermoleküle vorhanden sind. Und unsere Simulationen zeigen ebenfalls genau diesen Effekt: Die DNA und insbesondere die Nukleinbasenpaare, zwischen denen das Methylenblau eingelagert ist, schirmen den Farbstoff von den Lösungsmittelmolekülen ab. Die elektronisch angeregten Zustände des eingebetteten Methylenblaus zeigen also ein vergleichbares Verhalten wie im Vakuum und die Energie des angeregten Zustandes ist niedriger. Daher sollte also ein effizienter Energietransfer zu benachbarten Sauerstoffmolekülen möglich sein. Methylenblau könnte von daher ein idealer Wirkstoff für die Photodynamische Therapie sein.

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Im Widerspruch zu oben gesagtem stehen allerdings Experimente mit in guaninhaltiger DNA eingebettetem Methylenblau. Hier beobachtet man eine Abnahme der Fähigkeit, Singulettsauerstoff erzeugen zu können. Der Grund hierfür ist das Entstehen eines zusätzlichen Reaktionswegs durch die benachbarten Guanineinheiten. Guanin kann ein Elektron auf das angeregte Methylenblau übertragen. Die dabei entstehende reduzierte Form des Methylenblaus ist nicht mehr in der Lage, Energie auf benachbarte Sauerstoffmoleküle abzugeben. Die Möglichkeit des Energietransfers ist somit ausgelöscht.

Hier kommt nun der Chemiker mit seinem Wissen zum Einsatz. Die Vermutung liegt nahe, dass sich eventuell Derivate des Methylenblaus finden lassen, welche die wesentlichen, oben beschriebenen Eigenschaften der Grundsubstanz aufweisen. Insbesondere die Eigenschaft, effizient Licht absorbieren zu können und anschließend die überschüssige Energie an benachbarte Sauerstoffmoleküle übertragen zu können, soll erhalten bleiben. Andererseits soll die Elektronenübertragungsreaktion zwischen den Guanineinheiten und dem Farbstoff unterbunden werden.

Vielversprechende Modifikation des Wirkstoffs vorhersagen

Am besten lässt sich dies durch Einführen von Elektronendonorsubstituenten erzielen. Jeder Substituent lässt sich allerdings nicht verwenden, da der Farbstoff nicht beliebig groß werden darf. Ein geometrisch ausladendes Molekül würde die Fähigkeit verlieren, sich zwischen die Nukleinbasen einzulagern.

Theoretische Simulationen des Gesamtsystems, also des Methylenblauderivats eingebettet in den DNA-Strang können dabei helfen, vielversprechende Modifikationen vorherzusagen und somit den experimentellen Aufwand so gering wie möglich zu halten.

Betrachtet man den ganzen Prozess der Photodynamischen Therapie stellt sich natürlich immer wieder die Frage, wie kommt das Wirkstoffmolekül an sein Ziel? Methylenblau, welches an die DNA andockt, muss zuerst in die Zelle kommen. Prinzipiell denkbar sind dabei eine passive Penetration der Zellmembranen oder auch ein aktivierter Mechanismus unter Ausnutzung verschiedener Transportmechanismen der Zellen wie etwa Ionenkanäle. Interessant ist in diesem Zusammenhang auch die Frage nach den Transporteigenschaften des modifizierten Moleküls, zum Beispiel des Methylenblauderivats.

Auf molekularer Zeitskala seltene Ereignisse simulieren

Auch solche Fragestellungen lassen sich mithilfe von Computersimulationen angehen. Moderne Varianten der Moleküldynamik erlauben es, Ereignisse zu modellieren, die auf molekularer Zeitskala nur selten auftreten. Mittels stochastischer Verfahren lassen sich aus Simulationen von einigen hundert Nanosekunden Ereignisse im Millisekundenbereich studieren. Somit lässt sich zum Beispiel die vollständige Diffusion eines Methylenblaumoleküls durch die Zellmembran simulieren und verstehen.

Effizientere Wirkstoffe per Multiskalenmodellierung

Um ein abgerundetes Bild des Wirkstoffes und seiner Funktion auf molekularer Ebene zu bekommen, muss man verschiedene Simulationstechniken und Szenarien zusammen anwenden. Die durch diese Multiskalenmodellierung gewonnenen Erkenntnisse lassen sich gezielt dazu einsetzen, effizientere Wirkstoffe zu erzeugen und die zugrundeliegenden Mechanismen aufzuklären.

Die Autoren danken der Europäischen Kommission für die finanzielle Unterstützung im Rahmen des Marie-Curie Indiviualstipendiums „Photoblue“.

Literatur:

[1] J. J. Nogueira, L. González: Molecular Dynamics Simulations of Binding Modes between Methylene Blue and DNA with Alternating GC and AT Sequences. Biochemistry 53(14), 2391-2412 (2014).

[2] J. J. Nogueira, M. Oppel, L. González: Verstärkung der Interkombinationseffizienz von Phenotiaziniumfarbstoffen durch Einlagerung in DNA. Angewandte Chemie 127, 4450-4453 (2015).

* Dr. M. Oppel, Dr. J. J. Nogueira Pérez, Prof. Dr. L. González: Institut für Theoretische Chemie, Universität Wien, Österreich

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