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Dynamische Lichtstreuung Mittels Dynamischer Lichtstreuung Aggregate von therapeutischen Proteinen aufspüren

Autor / Redakteur: Thomas Jocks* / Dr. Ilka Ottleben

Die therapeutische Verwendung monoklonaler Antikörper hat in den letzten Jahren eine rasante Entwicklung genommen. Als Folge stieg auch die Nachfrage nach einer Analytik, die zuverlässig Auskunft über den Zustand der Präparate geben kann.Die dynamische Lichtstreuung (DLS) leistet hier gute Dienste.

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Die vorliegenden Messungen wurden mit dem Wyatt Dynapro Nanostar durchgeführt.
Die vorliegenden Messungen wurden mit dem Wyatt Dynapro Nanostar durchgeführt.
(Bild: Wyatt Technology Europe)

Seit mehreren Jahren kann man beobachten, wie eine besondere Familie von Proteinen ihre Nischenexistenz verlässt und zunehmend in den Fokus vieler Wissenschaftler tritt. Die Rede ist von Antikörpern, also einer bestimmten Klasse von Immunglobulinen. Ihre angestammte Funktion liegt in der Erkennung und der Mitwirkung bei der Abwehr von Bakterien, Viren oder anderen Strukturen wie körpereigenen (entarteten) Zellen, die vom Immunsystem als fremd eingestuft werden. Die Bindung eines Antikörpers an seine so genannte Zielstruktur erfolgt hoch spezifisch. In unserem Körper zirkulieren ständig unzählige Antikörper mit ebenso zahlreichen Spezifitäten. Dank der wegweisenden Arbeiten von Köhler und Milstein in den 1970er Jahren (Nature. Bd. 256, S. 495-497, 1975) kann man inzwischen eine nahezu beliebige Menge von Antikörpern mit genau gleicher, definierbarer Spezifität erzeugen, die so genannten monoklonalen Antikörper.

Heute werden diese bereits in therapeutischen Präparaten eingesetzt, so z.B. bei verschiedenen Krebs- und Autoim-munerkrankungen oder gegen Allergien. Auch zur Verhinderung der Transplantat-Abstoßung bedient man sich ihrer Wirkung. Leider sind Antikörper wie viele Proteine sehr empfindlich und bilden leicht unerwünschte Aggregate. Dies ist v.a. bei der Qualitätskontrolle zu beachten, denn Aggregate können ein solches Medikament unbrauchbar machen.

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Nachfolgend wird dargestellt, wie man die Dynamische Lichtstreuung (DLS) einsetzen kann, um die Qualität von Antikörper-Präparaten zu prüfen, Aggregate aufzuspüren und die jeweilige Formulierung hinsichtlich ihrer Stabilität zu beurteilen.

Proteinaggregate

Monoklonale Antikörper werden oftmals lyophilisiert, um sie lagerfähig zu machen. So kann man sie später in gewünschter Konzentration für die Anwendung wieder lösen. Obgleich dieser Vorgang so schonend wie möglich ausgeführt wird, bilden sich dabei doch häufig Proteinaggregate. Auch die vielfach angestrebten hohen Wirkstoffkonzentrationen können diesen Effekt verstärken, und zur Bildung von Oligomeren und Aggregaten beitragen. Ebenso kann das Lösemittel Einfluss auf die Stabilität einer solchen Präparation nehmen. Auch dieser Umstand ist daher in die vorliegende Untersuchung einbezogen.

Es wurden unterschiedliche Antikörperpräparate mit dem DLS-Instrument Wyatt Dynapro Nanostar vor und nach der Lyophilisierung untersucht und die Größe der Moleküle sowie ihr mittels Statischer Lichtstreuung gemessenes Molekulargewicht verglichen. Darüber hinaus ermittelte die Messung den Anteil der verschiedenen Fraktionen an der Gesamtmenge. Die Auswertung erledigte die Dynamics-Software mithilfe spezieller Algorithmen.

Welche Effekte zeigten die DLS-Messungen?

Die untersuchten Proben zeigten in der DLS-Messung einen veränderten, deutlich nach rechts verschobenen Verlauf der Messkurven wie auf Abbildung 1 zu sehen ist. Dieser Effekt ist auf die Bildung von Aggregaten zurückzuführen. Man kann sich das ungefähr so vorstellen: Gegenüber einer reinen Monomerlösung ist durch die Anwesenheit von Aggregaten die „durchschnittliche“ Größe der Teilchen, welche die DLS misst, etwas erhöht. Das bewirkt eine „Rechtsverschiebung“ der Kurve wie in der Abbildung gezeigt.

Auch das verwendete Lösemittel wirkt sich auf das Aggregationsverhalten der Probe aus. Man erkennt, dass der in Phosphatpuffer (PBS) gelöste Antikörper nach Lyophilisierung deutlich weniger aggregiert ist als das in Sucrose-haltigem Puffer gemessene Präparat.

In Abbildung 2 wird dargestellt, dass die Aggregate im Vergleich zu den Monomerfraktionen bezogen auf ihren Massenanteil ein wesentlich intensiveres Streulicht erzeugen. Aus der so genannten Prozent-Massen-Auswertung, einer speziellen Berechnungsfunktion der Dynamics-Software, ergibt sich für die aggregierten Antikörper in den beiden Präparaten, dass ihr Anteil an der Gesamtmasse lediglich 0,4 bzw. 1,2 % beträgt. Dennoch sind sie eindeutig nachweisbar. Dieser Befund verdeutlicht auch die hohe Empfindlichkeit der Methode.

Die thermische Stabilität einer Antikörperlösung lässt sich ebenfalls sehr gut mittels DLS untersuchen. Dazu wird die Probe einem ansteigenden Temperaturprofil ausgesetzt und dabei das Verhalten der Moleküle betrachtet.

In den Abbildungen 3 und 4 sind Messungen der Schmelzpunkte zweier Antikörper in verschiedenen Pufferlösungen aufgetragen. Der Beginn des Schmelzens ist durch die senkrechte gestrichelte Linie markiert. Während IgG_1 seine Stabilität bis zu einer Temperatur von knapp 67 °C beibehält, verliert IgG_2 schon bei etwa 61 °C seine ursprüngliche Struktur. Die Molekülradien zeigen, dass die hoch geordnete Struktur des Antikörperproteins, die aus energetischen Gründen nicht mehr aufrechterhalten werden kann, verloren geht. Der Antikörper geht dabei in einen quasi ungeordneten Zustand über. Er dehnt sich räumlich stärker aus, und die Lichtstreuung misst einen größeren hydrodynamischen Radius der Moleküle.

Sofern das Molekulargewicht der Makromoleküle bekannt ist, lassen sich auch noch weiter gehende Aussagen zu ihrem Verhalten treffen. Bestimmt man die Molekulargewichte allerdings allein mittels DLS, so werden diese nicht absolut, sondern lediglich anhand der Beziehung zwischen Radius und Masse berechnet. Die Ergebnisse sind deswegen mit einer gewissen Unsicherheit der Bestimmung behaftet, denn die aus dem hydrodynamischen Radius berechneten Daten hängen von der Tertiärstruktur des Proteins ab. Doch dieser Problematik kann man abhelfen: Das Dynapro Nanostar verwendet als einziges verfügbares DLS-Instrument eine zusätzliche 90°-Streulichtdiode für die Statische Lichtstreuung (SLS). Damit wird das Molekulargewicht absolut aus der Gesamtmenge des gestreuten Lichts bestimmt. Dies erfolgt allein aus den Messdaten und ohne weitere Annahmen über die Gestalt des Moleküls. Dadurch kann das Instrument simultan hydrodynamische Radien durch DLS und absolute Molekülgewichte mittels SLS messen. Mithilfe entsprechender Zusatzfunktionen der Dynamics-Software bekommt man auf diese Weise einen wertvollen Zugewinn an Informationen.

Überdies erlaubt die Software verschiedene Fitmethoden wie Starttemperatur und Wendepunktbestimmung, die beide automatisch arbeiten. Die Methode „linear“ ermöglicht eine manuelle Auswertung.

Abbildung 5 zeigt eine solche Messung – wiederum an der Reaktion einer Antikörperlösung auf den Anstieg der Temperatur. Dabei ist ein besonderer Effekt zu erkennen: In dem Bereich kurz vor Erreichen des Schmelzpunktes nimmt das Molekülgewicht offenbar ab. Wie kommt dies zustande? Die Erklärung ist in diesem Falle einfach: Die Lösung muss bereits bei Raumtemperatur einen deutlichen Anteil an Oligomeren besessen haben. Mit Erhöhung der Temperatur dissoziierten diese dann nach und nach, sodass sich diese „thermische Spaltung“ in einem Abnehmen der Molekulargewichte widerspiegelte. Mit Erreichen des Schmelzpunktes kehrte sich dieser Effekt aber um und zwei andere Vorgänge dominierten: Die Proteinstruktur brach zusammen und vergrößerte den gemessenen Radius (grün). Die schnell fortschreitende Aggregation trug ihrerseits zur Radiuserhöhung bei und sorgte außerdem für das Ansteigen des Molekulargewichts (blau).

Insgesamt gewinnt man durch die Daten aus DLS und SLS umfassende Einblicke sowohl in die statischen Verhältnisse als auch in die dynamischen Prozesse, die in einer Lösung von Makromolekülen ablaufen. Sie gehen aus der kombinierten Betrachtung aller relevanten Parameter hervor.

* Dr. T. Jocks: Wyatt Technology Europe GmbH, 56307 Dernbach

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