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Der Mensch zum Selberbauen?

Möglichkeiten und Grenzen Stammzell-basierter Testverfahren in der Wirkstoffforschung

| Autor / Redakteur: Prof. Dr. Jan G. Hengstler*, Wiebke Albrecht*, Tim Brecklinghaus*, David Feuerborn*, Patrick Nell*, Anna Cherianidou**, Dr. Karolina Edlund*, Prof. Dr. Agapios Sachinidis** / Dr. Ilka Ottleben

Stammzell-abgeleitete Leberzellen: Gut aber nicht gut genug?

Doch warum sind Stammzell-abgeleitete Leberzellen noch nicht gut genug für Routineanwendungen? Aus Stammzellen gewonnene Zellen weichen noch erheblich von primären Zellen ab. Genomweite Analysen der mRNA haben gezeigt, dass Hunderte Gene stark unterschiedlich exprimiert werden. Dabei wird ein besonderes Muster erkennbar: Zum einen sind viele Gene, welche in primären Hepatozyten stark exprimiert werden, in den aus Stammzellen abgeleiteten Zellen zu schwach vertreten. Ein zweites Phänomen besteht darin, dass die aus Stammzellen abgeleiteten Zellen Gene exprimieren, welche in primären Hepatozyten nicht zu finden sind; dies sind z.B. Gene, welche von Darmepithelzellen und ihren Vorläufen gebildet werden, also eine „unerwünschte Entwicklung“ zeigen.

Entwicklungstoxikologie

Leider ist es noch nicht möglich, aus hiPSC ausgereifte menschliche Zellen herzustellen, welche sich von primären Zellen kaum unterscheiden. Es ist aber sehr gut möglich, Stammzellen ein Stück weit zu reiferen Vorläuferzellen zu differenzieren. Während dieser Differenzierungsperiode können Chemikalien zugesetzt werden, um zu untersuchen, ob diese Substanzen die Entwicklung stören.

Dies wird am besten als genomweite Expressionsanalyse durchgeführt. Dabei wird ein besonderes Augenmerk auf Entwicklungsgene gelegt, also Gene die während der Entwicklungsphase in der Kulturschale ohne Substanzzusatz hoch- oder runterreguliert werden. Eine hilfreiche Maßzahl ist dann der Anteil an Entwicklungsgenen, dessen normale Hoch- oder Herunterregulation durch die Prüfsubstanz gestört wird. Bei Substanzen, welche die menschliche Em­bryonalentwicklung stören, z.B. Valproinsäure oder Methylquecksilber, ist dieser Anteil deutlich im Vergleich zu harmlosen Substanzen erhöht. Trotz dieser erfolgreichen ersten Ergebnisse stehen umfassende Studien noch aus.

Wie geht es weiter?

Die Zukunft stammzellbasierter Methoden hängt davon ab, ob es gelingen wird, reife menschliche Körperzellen mit ausreichender Ähnlichkeit zu den entsprechenden primären Zellen herzustellen. Hierbei kann das Wissen um die oben erwähnten zu schwach exprimierten Gene und die „unerwünschten Gene“ hilfreich sein. Denn es ist bekannt, durch welche Transkriptionsfaktoren diese Gene reguliert werden. Daher ist es folgerichtig, diese in Zukunft zu adjustieren.

Es bleibt jedoch Ermessensspielraum, ab wann man eine Ähnlichkeit als ausreichend ansieht, um eine mögliche Eignung für toxikologische Tests zu prüfen. Schließlich kann man grobe Abschätzungen zytotoxischer Wirkungen schon mit herkömmlichen Zelllinien erreichen. Doch organspezifische Wirkungen setzen voraus, dass die Zellen die für ein Organ relevanten Funktionen möglichst genau wiedergeben – etwa die Fähigkeit zum Fremdstoffmetabolismus der Leber oder Erregungsbildung und Kontraktion von Herzmuskelzellen. Trotzdem kann ein zellbasiertes Testverfahren selbst dann sinnvoll sein, wenn noch nicht alle Eigenschaften und Funktionen perfekt mit primären Zellen übereinstimmen.

Eine Roadmap

Eine Prüfung der Eignung und weitere Optimierung kann entlang der im Folgenden beschriebenen Strategie zur Testentwicklung erfolgen (s. Abb. 4).

Zunächst ist es sinnvoll, Goldstandardsubstanzen und Signalwegkontrollen zu untersuchen. Für Goldstandardsubstanzen ist der toxische Wirkmechanismus gut verstanden und toxische als auch harmlose Dosisbereiche sind bekannt. Paracetamol ist ein Beispiel, das diese Kriterien erfüllt. Liefert ein zellbasierter Test für Lebertoxizität bei Konzentrationen zwischen 1 und 2 mM keine positiven (toxischen) Ergebnisse, dann sollte die Entwicklung abgebrochen und zunächst das Zellsystem verbessert werden. Signalwegkontrollen greifen in bekannter Weise in Abläufe der Signaltransduktion ein. So sollten Wnt-Inhibitoren ein positives Ergebnis in zellbasierten Tests für Entwicklungstoxizität liefern.

Nach der erfolgreichen Testung der Goldstandards – ein Schritt, bei dem viele neue Tests scheitern – kommt die nächste Stufe. Hierfür benötigt man etwa 20 positive als auch negative Kontrollsubstanzen für die bekannt sein muss, zu welchen Blutkonzentrationen eine bestimmte (z.B. oral aufgenommene) Dosis führt. Hierfür kann die Cmax verwendet werden, die maximale Blutkonzentration. Weiterhin muss bekannt sein, ob die orale Dosis der Kontrollsubstanzen Toxizität verursacht oder nicht. Die Ergebnisse werden dann in ein Koordinatensystem eingetragen, mit Cmax auf der y-Achse und der niedrigsten im zellbasierten Test toxischen Konzentration auf der x-Achse.

Im Beispiel (s. Abb. 3) sind hepatotoxische und nicht-hepatotoxische Substanzen rot bzw. grün dargestellt. Je weiter die roten und grünen Symbole auseinanderliegen, desto besser die Testperformance. Die Güte dieser Separierung wird durch den Toxizitätsseparierungsindex (TSI) numerisch ausgedrückt. Der Vorteil von Leistungsindices wie dem TSI besteht darin, dass so stammzellbasierte Tests systematisch optimiert werden können; es kann nachvollzogen werden, ob eine vermeintliche Verbesserung des Protokolls auch wirklich zu einem besseren TSI führt. Nach dieser Verbesserungsphase muss geprüft werden, ob sich der optimierte Test auch bei weiteren Substanzen und in unabhängigen Labors bewährt. Für einen ausgereiften Test sollten Daten von mehreren Hundert positiven und negativen Substanzen vorliegen und herkömmliche statistische Gütekriterien wie Sensitivität und Spezifität sollten bekannt sein.

Schon heute unterstützen stammzellbasierte Testverfahren toxikologische Entscheidungsprozesse. Doch bis zur Einführung in die Routine und zur behördlichen Akzeptanz ist noch ein weiter Weg.

Literatur:

[1] Reif R, Karlsson J, Günther G, Beattie L, Wrangborg D, Hammad S, Begher-Tibbe B, Vartak A, Melega S, Kaye PM, Hengstler JG, Jirstrand M: Bile canalicular dynamics in hepatocyte sandwich cultures. Arch Toxicol. 2015 Oct;89(10):1861-70. doi: 10.1007/s00204-015-1575-9. Epub 2015 Aug 18.

[2] Albrecht W, Kappenberg F, Brecklinghaus T, et al: Prediction of human drug-induced liver injury (DILI) in relation to oral doses and blood concentrations. Arch Toxicol. 2019 Jun;93(6):1609-1637. doi: 10.1007/s00204-019-02492-9.

[3] Sachinidis A, Albrecht W, Nell P, ­Cherianidou A, Hewitt NJ, Edlund K, Hengstler JG.: Road Map for Development of Stem Cell-Based Alternative Test Methods. Trends Mol Med. 2019 Jun;25(6):470-481. doi: 10.1016/j.molmed.2019.04.003.

* Prof. Dr. J. G. Hengstler, W. Albrecht, T. Brecklinghaus, D. Feuerborn, P. Nell, Dr. K. Edlund: Leibniz Institut für Arbeitsforschung an der TU Dortmund (IfADo), Forschungsbereich Toxikologie/Systemtoxikologie, 44139 Dortmund

* *A. Cherianidou, Prof. Dr. A. Sachinidis: Universität zu Köln, Zentrum Physiologie und Pathophysiologie, Institut für Neurophysiologie, 50931 Köln

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