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Steroid-Hormone Nachweis von Steroid-Hormonen in Wasser mittels HPLC-MS/MS

Autor / Redakteur: Friedrich Werres*, Peter Balsaa*, Sebastian Kowal*, Kristina Lang** / Dr. Ilka Ottleben

Moderne Verfahren der HPLC-MS/MS ermöglichen es, gewässerrelevante Vertreter endokrin wirksamer Stoffe wie synthetische und natürliche Steroide sehr empfindlich und gleichzeitig robust und mit einem hohen Automatisierungsgrad nachzuweisen.

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HPLC-MS/MS Messplatz einschließlich der Online-SPE
HPLC-MS/MS Messplatz einschließlich der Online-SPE
(Bild: IWW)

Hormone sind in der Natur von großer Wichtigkeit und besitzen vielfältige Aufgaben, die sich mehr oder weniger auf den gesamten Organismus einer Spezies auswirken. Die Regulierung von Wachstum aber auch die Funktion von reproduktivem Gewebe steht unter dem Einfluss und der Wirkung von Steroidhormonen. Synthetisierte Hormone wie auch andere Chemikalien, die auf die Funktion des Hormonsystems einwirken (hormonell wirksame Stoffe oder endokrin wirksame Stoffe), können sich ebenfalls auf die Entwicklung des Wachstums oder die Fortpflanzung von Mensch und Tier auswirken. So wurde das vereinzelte Auftreten hoher Konzentrationen hormonell aktiver Stoffe in der aquatischen Umwelt u.a. für eine beobachtete Verweiblichung bestimmter männlicher Fische verantwortlich gemacht [1].

Die europäische Gesetzgebung hat mit der Richtlinie 2000/60/EG unter Einbeziehung verschiedener Nachträge und Änderungen strenge Qualitätsziele für den Gewässerschutz eingeführt [2-4]. Mit dem neuesten Änderungsvorschlag der Richtlinie, die vor allem unter der Bezeichnung „Wasserrahmenrichtlinie“ (WRRL) bekannt ist, wurden weitere Verschärfungen vorgeschlagen. So wurden in die Liste der so genannten prioritären bzw. prioritär gefährlichen Stoffe u.a. auch die natürlichen und synthetischen Steroide 17-α-Ethinylestratiol und 17-β-Estradiol aufgenommen und für deren Überwachung sehr niedrige Jahresdurchschnitts-Umweltqualitätsnormen (JD-UQN) gefordert [5]. Sie betragen in Binnengewässern 0,035 ng/L (17-α-Ethinylestratiol) bzw. 0,4 ng/L (17-β-Estradiol). Darüber hinaus ist zu beachten, dass für die Analytik Bestimmungsgrenzen gefordert werden, die lediglich 30% des jeweiligen UQN-Werts betragen dürfen [6]. Voraussetzung für die Umsetzung der Maßnahmen ist aber, dass geeignete Kontrollinstrumente (Analysenverfahren) existieren, die schnell und zuverlässig die Identifizierung und Quantifizierung von Stoffen in niedrigsten Konzentrationen ermöglichen. Diese Situation wirkt sich somit direkt auf Labore aus, die mit der Untersuchung von Oberflächenwässern einschließlich küstennaher Gewässer auf Xenobiotika betraut sind. Derzeit wird mit den in der Routine genutzten und etablierten Verfahren häufig noch nicht die geforderte Empfindlichkeit erreicht. Die Umsetzung analytischer Anforderungen macht somit die Entwicklung neuer Verfahren im Laboralltag dringend erforderlich.

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Wahl der geeigneten Analysetechnik

Für die Bestimmung hormonell wirksamer Substanzen werden bisher sowohl GC- als auch HPLC-Verfahren in der Routine genutzt. GC-Verfahren erfordern für Steroide meist zusätzlich einen Derivatisierungsschritt, um die Polarität der Analyten den Bedingungen der Gaschromatographie (GC-Säule) anzupassen [7]. Leider wirken sich aufwändige Verfahrensschritte häufig negativ auf die Reproduzierbarkeit aus und damit auf die Verlässlichkeit des Gesamtverfahrens. Bestimmungsgrenzen im unteren ng/L-Bereich lassen sich darüber hinaus mittels GC oft nur erreichen, wenn große Probenvolumina (z.B. 1000 mL) eingesetzt werden. Hiermit wird eine starke Aufkonzentrierung der Zielkomponenten angestrebt. Um Anreicherungsfaktoren von 1:1000 bis 1:5000 zu erhalten, werden in der Regel entweder die Flüssig-/Flüssig-Extrakton (LLE) oder die Festphasenextraktion (SPE) eingesetzt. Diese Verfahren sind jedoch sehr zeit-, personal- sowie kostenintensiv.

Ziel der Arbeit war es, auf der Basis der HPLC ein robustes und schnelles Verfahren mit einem möglichst hohen Automatisierungsgrad zu entwickeln. Die Anreicherung von größeren Probenvolumina sollte vermieden werden. Neben Anregungen aus der Literatur [8] bildeten die sehr guten eigenen Erfahrungen mit dem Direktinjektionsverfahren in Kombination mit einer HPLC-MS/MS hierbei die Basis für weitere Entwicklungen [9, 10] eines Verfahrens zur Bestimmung ausgewählter Steroide in Trink-, Grund- und Oberflächenwässern. Um möglichst niedrige Bestimmungsgrenzen zu erreichen, wurde neben der Direktinjektion auch ein Verfahren der Online-Anreicherung (Online-SPE) entwickelt.

Direktinjektion

Zunächst wurde für sechs ausgewählte Hormone (s. Tabelle 1) eine HPLC-MS/MS-Methode erarbeitet. Die chromatographischen und spektroskopischen Betriebsbedingungen wurden an einer Waters Acquity UPLC Xevo TQ-S optimiert und sind in den Tabellen 2 und 3 zusammengefasst. Die Injektion wurde hinsichtlich variabler Aufgabevolumina optimiert. Es zeigte sich, dass auch große Injektionsvolumina von bis zu 250 µL unproblematisch sind, eine weitere Steigerung bis zu 1000 µL aber keine nennenswerten Vorteile bieten. Die Direktinjektion erfordert prinzipiell keine Probenvorbereitung, da auf einen Anreicherungsschritt zur Aufkonzentrierung der Analyten verzichtet wird. Für schwebstoffhaltige Proben (z.B. Oberflächenwasserproben) empfiehlt sich jedoch eine vorherige Filtration der Wasserprobe mittels Glasfaserfilter, um Verstopfungen des Injektionssystems auszuschließen. Dies lässt sich bequem mittels Spritzenvorsatzfilter unmittelbar vor der Bestückung des Probengebers erledigen. Die Methode ist vollständig automatisierbar. Im Rahmen der Validierungsexperimente wurden im Konzentrationsbereich von 2 bis 100 ng/L sehr gute Ergebnisse zur Linearität und Verfahrensreproduzierbarkeit erreicht. Standardadditionsversuche mit dotierten Wässern unterschiedlicher Matrix konnten die Eignung des Verfahrens für die Untersuchung von Oberflächenwässern belegen. Für alle untersuchten Stoffe lagen die Bestimmungsgrenzen stets mindestens zwischen 5 ng/L und 10 ng/L (s. Tabelle 4 und 5).

Online-Anreicherung der Hormon-Steroide

Aufbauend auf den Ergebnissen des Direktinjektionsverfahrens wurde zur Verbesserung der Bestimmungsgrenzen ein Online-SPE-Verfahren entwickelt. Das System der Firma Waters bot hierzu mit seinen beiden unabhängigen Pumpensystemen und mehreren 6-Wege-Schaltventilen eine geeignete Basis (s. Abb. 1d). Mit dem zusätzlichen Pumpensystem (QSM = quaternary solvent manager) erfolgte die Online-Anreicherung, während die binäre Pumpe (BSM = binary solvent manager) die Elution und Chromatographie (UPLC) durchführte. Alle notwendigen Verfahrensschritte ließen sich vollständig automatisieren und es wurde eine hohe Verfahrensreproduzierbarkeit erreicht. Für den Betrieb der Online-SPE werden zusätzliche Schaltventile benötigt, um die SPE-Anreicherungssäule zu konditionieren, die Substanzen aus der Probe anzureichern und im Gegenstrom auf die chromatographische Säule zu eluieren. Im Rahmen einer Verfahrensvalidierung wurden verschiedene wichtige Einflussgrößen optimiert. Dies betraf z.B. die Auswahl geeigneter SPE-Säulen für die Probenanreicherung sowie die Chromatographie-Trennsäulen. Ferner wurde das Probenvolumen sowie die Fließgeschwindigkeit für die Beladung und die Elution optimiert.

Notwendige Ventilschaltungen

Zur Verdeutlichung sind die notwendigen Ventilschaltungen in einer schematischen Übersicht (s. Abb. 1a bis d) dargestellt und nachfolgend skizziert:

  • a) Injektion: Eine 5-mL-Probenschleife (Loop) wird mit der ggf. zuvor filtrierten Wasserprobe befüllt. Parallel erfolgt die Konditionierung der SPE-Anreicherungssäule mit dem zusätzlichen Pumpensystem (QSM).
  • b) Extraktion: Ventil V 1 wird geschaltet und die Probe wird im Anreicherungsschritt mittels des QSM über die SPE-Anreicherungssäule gefördert. Die Anreicherungsgeschwindigkeit beträgt 2 mL/min. Die Extraktion der Komponenten ist somit nach 2,5 min abgeschlossen.
  • c) Elution: Nun wird Ventil V 2 geschaltet und der BSM eluiert die extrahierten Stoffe im Backflushmodus von der SPE-Anreicherungssäule. Mit dem Elutionsfluss gelangen sie zur Auftrennung und Detektion über die Chromatographiesäule in das Massenspektrometer. Die Elution erfolgt mit dem für die Chromatographie genutzten Laufmittelgemisch.

In Tabelle 2 (laborpraxis.de) sind die chromatographischen Bedingungen zum Online-SPE-Verfahren skizziert, Abbildung 2 zeigt beispielhaft die Totalionenchromatogramme (TIC) der sechs untersuchten Hormone. Die Tabellen 4 und 5 enthalten die aus den Validierungsversuchen gewonnenen Verfahrenskenndaten. Die Ergebnisse zeigen, dass sich die untersuchten Steroide empfindlich und sehr reproduzierbar analysieren lassen. Die Matrix der untersuchten Oberflächenwässer wirkte sich im Vergleich zur Matrix weniger belasteter Wässer (Grund- und Trinkwässer) nicht signifikant nachteilig auf die Lebensdauer der Anreicherungssäule aus.

Fazit

Sowohl die schnelle Direktinjektion als auch die sensitivere Online-SPE eignen sich für die Bestimmung synthetischer und natürlicher Steroide mittels HPLC-MS/MS. Für beide Verfahren wurde die Validierung unter Einbeziehung der Standardaddition mittels dotierter Trink-, Grund und Oberflächenwässer durchgeführt. Hierbei wurde jeweils eine hohe Robustheit festgestellt.

Literatur

[1] Suter M. J.-F. et al.: Wie wirkt die Pille auf den Fisch? EAWAG news 53, 24-25, (2002).

[2] Directive 2000/60/EC of the European Parliament and of the Council of 23 October 2000 establishing a framework for Community action in the field of water policy, Official Journal of the European Communities (2000).

[3] Decision No 2455/2001/EC of the European Parliament and of the Council of 20 November 2001 establishing the list of priority substances in the field of water policy and amending Directive 2000/60/EC, Official Journal of the European Communities (2001).

[4] Directive 2008/105/EC of the European Parliament and of the Council of 16 December 2008 on environmental quality standards in the field of water policy, amending and subsequently repealing Council Directives 82/176/EEC, 83/513/EEC, 84/156/EEC, 84/491/EEC, 86/280/EEC and amending Directive 2000/60/EC of the European Parliament and of the Council, Official Journal of the European Union (2008).

[5] Proposal for a Directive of the European Parliament and of the Council amending Directives 2000/60/EC and 2008/105/EC as regards priority substances in the field of water policy, COM(2011) 876 final, Brussels, 31.1.2012.

[6] Commission Directive 2009/90/EC of 31 July 2009 laying down, pursuant to Directive 2000/60/EC of the European Parliament and of the Council, technical specifications for chemical analysis and monitoring of water status, Official Journal of the European Union (2009).

[7] Hernando, M. D., Mezcua, M., Gómez, M. J., Malato, O., Agüera, A., Fernández-Alba, A. R.: Comparative study of analytical methods involving gas chromatography–mass spectrometry after derivatization and gas chromatography–tandem mass spectrometry for the determination of selected endocrine disrupting compounds in wastewaters. Journal of Chromatography A 1047, 1, 129-135 (2004).

[8] Seitz, W., Holzschuh, C., Weber, W.: Bestimmung von Estrogenen in Wasesr durch HPLC-MS/MS mit großvolumiger Injektion (LVI) bzw. Online SPE. Jahrestagung der Wasserchemischen Gesellschaft, Wasser 2012, GDCh (2012).

[9] Kowal, S., Balsaa, P., Werres, F., Schmidt, T. C.: Determination of the polar pesticide degradation product N,N-dimethylsulfamide in aqueous matrices by UPLC-MS/MS. Anal Bioanal Chem 395:1787-1794 (2009).

[10] Kowal S., Balsaa P., Werres F., Schmidt T. C.: Reduction of matrix effects and improvement of sensitivity during determination of two chloridazon degradation products in aqueous matrices by using UPLC-ESI-MS/MS Anal Bioanal Chem 395:1787-1794 (2012).

* Dr. F. Werres, Dr. P. Balsaa, S. Kowal: IWW Rheinisch-Westfälisches Institut für Wasser, 45476 Mülheim an der Ruhr

* *K. Lang: Universität Duisburg-Essen, 45141 Essen

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