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Fremdmoleküle in Zellen einbringen Nanoinjektion: Kleiner Stich, große Wirkung

Autor / Redakteur: Simon Hennig* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Das Einbringen von Fremdmolekülen in lebende Zellen ist für Forscher oft eine große Herausforderung. Die Zellmembran stellt für viele Moleküle eine unüberwindbare Hürde dar. Die Nanoinjektion bietet eine vielfältig einsetzbare Methode, um Moleküle in einzelne lebende Zellen zu injizieren.

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Der erste Schritt der Nanoinjektion: Die Nanopipette wird ca. 20µm über der Zelle manuell positioniert.
Der erste Schritt der Nanoinjektion: Die Nanopipette wird ca. 20µm über der Zelle manuell positioniert.
(Bild: Uni Bielefeld)

Wie können Fremdmoleküle in lebende Zellen eingebracht werden? Das ist die Frage, mit der sich Wissenschaftler in den Biowissenschaften und verwandten Disziplinen oft konfrontiert sehen. Dabei geht es darum, entweder die Wirkung von bestimmten Molekülen auf eine lebende Zelle zu beobachten, also zu schauen, wie eine Zelle auf einen bestimmten Typ Moleküle reagiert. Zum anderen wollen Forscher spezielle Moleküle als Marker in die Zelle bringen, um Strukturen oder Interaktion von intrazellulären Kompartimenten oder Proteinen mithilfe von z.B. der Fluoreszenzmikroskopie zu beobachten. In jedem Fall steht aber die Zellwand der intakten Zelle dem erfolgreichen Einbringen von Molekülen im Weg, denn die Zelle besitzt mit der Zellwand eine Barriere die nur bestimmte Moleküle passieren lässt und unerwünschte Moleküle abblockt.

Wie lässt sich eine intakte Zellmembran überwinden?

Über die Zeit wurden verschiedene Methoden entwickelt, um dieses Problem zu lösen. So können die Methoden grob in Ensemblemethoden und Einzelzellmethoden unterteilt werden. Ensemblemethoden sind dazu geeignet, Fremdmoleküle in sehr viele Zellen auf einmal einzubringen und nutzen überwiegend physikalische Prinzipien.

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Als Beispiele kann hier die „Electroporation“ [1], „Glass-Bead Loading“ [2], „Optoporation“ [3] oder „Cell-Squeezing“ [4] genannt werden. Oder sie nutzen chemische Ansätze, beispielsweise „Streptolysin-O (SLO)“ [5].

Einzelzellmethoden sind in der Lage, Moleküle in eine einzelne Zelle zu bringen. Hier hat sich über die Jahre die Mikroinjektion mit unterschiedlichen Variationen wie der „Nanoblade-Delivery“ [6] bewährt, bei der Moleküle ähnlich wie bei einer Spritze mit einer sehr kleinen Spitze über Druck in eine Zelle injiziert werden.

Welche Nachteile haben derzeitige Methoden?

Die bisher entwickelten Methoden haben den Nachteil, dass das Überleben von Zellen nicht oder nur unzureichend berücksichtigt wird. So liegt die Überlebensrate für alle Ansätze typischerweise bei 50 bis 70%, und ist stark abhängig von den verwendeten Zellen. Ein weiterer Aspekt ist der, dass die Menge an eingebrachten Molekülen nicht oder nur schwer kontrolliert werden kann. Abgesehen von der Vielzahl der Lösungen gibt es derzeit nur eine Standardlösung für die Manipulation von einzelnen Zellen, nämlich die Mikroinjektion.

Was ist Nanoinjektion und wie wird sie durchgeführt?

Die Nanoinjektion [7] ist eine relativ neu entwickelte Methode zum Einbringen von Fremdmolekülen in einzelne Zellen, die die Schwächen bisheriger Entwicklungen beseitigt. Die Methode benutzt dabei einen ähnlichen Ansatz wie die Mikroinjektion. Im Gegensatz zu dieser werden bei der Nanoinjektion aber Pipetten mit einem fünf- bis zehnmal kleinerem Durchmesser eingesetzt. Die typische Pipettengröße liegt hier bei einem Durchmesser von 100 nm. Der Einsatz kleinerer Pipettendurchmesser ist möglich, da der Ausstoß von Molekülen aus der Pipette nicht wie bei der Mikroinjektion über Druck, sondern über elektrophoretische Kräfte geschieht. Ein weiterer daraus resultierender Vorteil ist die genaue Positionierbarkeit der Pipette, da die Position der Pipettenspitze relativ zu der Zellmembran über einen kleinen Strom gemessen werden kann, der zwischen der Pipette und einer Gegenelektrode im Bad fließt. Der Benutzer weiß also sehr genau, wann die Spitze an der Zellmembran und wann sie in der Zelle ist. Darüber hinaus lässt sich sogar bestimmen, wann die Pippettenspitze in einem intrazellulären Kompartiment wie dem Zellkern ist. Das ermöglicht selektives Einbringen von Fremdmolekülen nicht nur in die Zelle, sondern auch selektiv in den Zellkern.

Diese Methode ist sanfter als bisher verwendete Methoden, da während der Injektion von Molekülen die Zellmembran nur an einem Punkt durchstoßen wird. Durch den kleinen Spitzendurchmesser wird die beschädigte Fläche der Membran sehr klein gehalten. Zudem wird im Gegensatz zur Mikroinjektion die Zelle nicht durch einen übermäßigen Volumentransfer belastet. Es konnte daher für Nanoinjektion eine Überlebensrate von 92% für injizierte Zellen ermittelt werden [8]. Neben dem reinen Überleben der einzelnen Zelle, ist die Frage nach dem natürlichen Verhalten injizierter Zellen eine sehr wichtige, da Beobachtungen an der Zelle direkte Rückschlüsse auf Abläufe innerhalb der Zelle geben sollen. Ein wichtiger Indikator ist hier die Teilungsrate, die sich auch nach einer Manipulation mit Nanoinjektion nachweislich normal verhält.

Wo wird die Nanoinjektion angewendet?

Entwickelt und genutzt wurde und wird Nanoinjektion bisher hauptsächlich mit fluoreszierenden Molekülen in der Fluoreszenzmikroskopie. Da viele fluoreszierende Marker nicht oder nur schwer in lebende Zellen zu bringen sind, bietet die Nanoinjektion eine einfache Lösung für dieses Problem. Die Menge an injizierten Molekülen kann dabei direkt unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachtet und gesteuert werden. Die Nanoinjektion bietet sich vor allem an, um hoch- und höchstauflösende Fluoreszenzmikroskopie an lebenden Zellen anzuwenden. Für diese Art der Fluoreszenzmikroskopie kommen überwiegend spezielle Fluoreszenzmarker zum Einsatz, die von außen in die Zelle gebracht werden müssen und für die die Zellmembran der lebenden Zelle ein unüberwindbares Hindernis darstellen. Aber auch spezielle Zellarten, deren Beobachtung durch fluoreszenzmikroskopische Methoden erschwert ist, wie Primärzellen lassen sich mithilfe der Nanoinjektion sehr leicht beobachten. Ebenso ist eine Injektion mehrerer Fluoreszenzmarker zur Markierung unterschiedlicher Strukturen innerhalb der Zelle sehr einfach zu realisieren. Dabei können die jeweils gewünschten Strukturen gleichzeitig oder hintereinander markiert werden.

Wie kann die Nanoinjektion noch genutzt werden?

Die Nanoinjektion ist vielfältig einsetzbar. Sie kann überall dort eingesetzt werden, wo die Zellmembran einer lebenden Zelle eine natürliche Barriere gegenüber Fremdmolekülen bildet. Die hohe Überlebensrate und die normale Teilungsrate von injizierten Zellen lassen den Schluss zu, dass die Injektion kaum Einfluss auf den natürlichen Zellzyklus hat und die folgende Beobachtung der Zellen als natürlich angesehen werden kann. Weiterhin ist das selektive Injizieren von Molekülen in den Zellkern eine attraktive Anwendung, um .z.B. Transportprozesse aus dem Zellkern direkt sichtbar zu machen. Auch die Injektion von Molekülen in einzelne Zellen, die Teil eines Ensembles sind stellt sich als attraktive Methode heraus, um direkt die Kommunikation der inji­zierten Zelle mit anderen Zellen sichtbar zu machen.

Gleichzeitig könnte Nano­injektion aufgrund der verwendeten Pipette und des Feedbacksystems auch auf kleinere Objekte wie Hefezellen angewendet werden, deren Manipulation oft eine noch größere Herausforderung darstellt.

Literatur

[1] Neumann, E.; Schaefer-Ridder, M.; Wang, Y.; Hofschneider, P. H. Gene Transfer into Mouse Lyoma Cells by Electroporation in High Electric Fields. EMBO J 1982, 1, 841-5.

[2] McNeil, P. et al. Glass Beads Load Macromolecules into Living Cells. J Cell Sci 1987, 88 ( Pt 5), 669-78.

[3] Tsukakoshi, M.; Kurata, S.; Nomiya, Y.; Ikawa, Y.; Kasuya, T. A Novel Method of DNA Transfection by Laser Microbeam Cell Surgery. Appl Phys B-Photo 1984, 35, 135-140.

[4] Sharei, A et al. A Vector-Free Microfluidic Platform for Intracellular Delivery. Proc Natl Acad Sci U S A 2013, 110, 2082-7.

[5] Walev, I. et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. PNAS 2001 98 (6) 3185-3190.

[6] Xu, J.; Teslaa, T.; Wu, T. H.; Chiou, P. Y.; Teitell, M. A.; Weiss, S. Nanoblade Delivery and Incorporation of Quantum Dot Conjugates into Tubulin Networks in Live Cells. Nano Lett 2012, 12, 5669-72.

[7] Hennig, S. et al. Instant live-cell super-resolution imaging of cellular structures by nanoinjection of fluorescent probes. Nano letters 15, 1374-1381, (2015).

[8] Simonis, M. et al. Survival rate of eukaryotic cells following electrophoretic nanoinjection Scientific Reports 7, 41277, (2017).

* *Dr. S. Hennig: Universität Bielefeld, Fakultät für Physik, Biomolecular Photonics, 33615 Bielefeld

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