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Multiwellplatte Neuartige Multiwellplatte ermöglicht Lauschangriff auf lebende Zellen

Autor / Redakteur: Bernhard Becker*,**, Peter Wolf*,**, Martin Brischwein**, Helmut Grothe**, Marlies Zottmann*,**, Reg / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Zellbasierte Untersuchungen im Hochdurchsatzverfahren spielen im Laboralltag eine zunehmend wichtige Rolle. Ein Team um Prof. Dr. Bernhard Wolf vom Heinz-Nixdorf-Lehrstuhl für Medizinische Elektronik der Technischen Universität München hat in Kooperation mit HP Medizintechnik ein multiparametrisches System zur automatischen Durchführung zellbasierter Assays entwickelt. Lesen Sie, welche Einsatzmöglichkeiten diese neuartige Multiwellplatte bietet.

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Zellbasierte Assays sind einer der am schnellsten wachsenden Märkte im Bereich der Biotechnologie und Pharmazeutik. Sie erlauben es u.a. toxische Effekte von Substanzen schnell abzuschätzen oder ineffektive Wirkstoffkandidaten, im Vorfeld von kostenintensiven klinischen Studien, zu selektieren. Im Bereich der Geräteentwicklung geht der Trend hierbei zur Automatisierung und Parallelisierung. Inzwischen sind eine Reihe unterschiedlicher Geräte bzw. Messmethoden erhältlich, die verschiedene Parameter der zu untersuchenden Zellen detektieren, um daraus relevante Erkenntnisse zum Zustand der Zellen zu gewinnen. Manche Effekte lassen sich dabei gut über (licht-)mikroskopische Beobachtung beurteilen, andere greifen in den Stoffwechsel ein und sind deshalb über metabolische Veränderungen wie Säuerabgabe und Sauerstoffverbrauch der Zellen sichtbar. Zur Detektion morphologischer und proliferativer Veränderungen der Zelle bieten sich Anwendungen aus dem Bereich der Impedanzmessung biologischer Membranen an. Dabei steht jedoch bei vielen momentan erhältlichen Systemen in der Regel ein Parameter im Vordergrund (z.B. Impedanz oder Mikroskopie), über den alle aufgetretenen Effekte und Veränderungen im Messsignal interpretiert werden müssen. Hierdurch wird der Spielraum für den späteren Anwender eingeschränkt. Zusätzlich zu den sensorischen Herausforderungen stellt die Automatisierung und Parallelisierung, insbesondere bei der Untersuchung lebender Zellen, ingenieurtechnische Aufgaben bei der Entwicklung automatischer Lebenserhaltungs- und Wirkstoffzugabesysteme.

Kombination von Screeningmethoden durch modulares System

Am Heinz-Nixdorf-Lehrstuhl für Medizinische Elektronik der TU München wurden aus diesem Grund in den vergangenen Jahren Kompetenzen entwickelt, mit dem Bestreben, die Vorteile der derzeit verfügbaren Technologien zu vereinen [1, 2]. Das daraus hervorgegangene IMR-System (Intelligent Microplate Reader) (s. Abb. 2) ist modular aufgebaut und besteht, neben einem Pipettierroboter für die Medien- und Wirkstoffversorgung, aus der Sensorik für Impedanz- und Metabolismusmessungen und einem automatischen Mikroskop [3]. Das gesamte System ist in einem Zellkulturschrank untergebracht, der für gleichbleibende Umweltbedingungen sorgt. Dadurch sind flexible und beliebig lange Experimente möglich. Dieses System wurde im Rahmen eines BMBF-geförderten Projekts entwickelt und wird zukünftig durch HP Medizintechnik in den Markt eingeführt.

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Multiwellplatte mit Mikrofluidik-Kanälen

Herzstück des Screening-Systems ist eine modifizierte Multiwellplatte (s. Abb. 1). In ihr sind Sensoren für pH, pO2 und Impedanz untergebracht, die von außen ausgelesen werden und deren Messwerte jederzeit in Echtzeit am Computer verfolgt werden können. Die Platte besitzt 24 komplett mit Sensoren bestückte Wells, wodurch 24 unabhängige Experimente gleichzeitig möglich sind. Jedes Well besitzt eigene, in die Multiwellplatte eingearbeitete Mikrofluidik-Kanäle, die einen definierten Mediendurchsatz im Zellkulturbereich ermöglichen. Medienwechsel sind darüber automatisier- und reproduzierbar und führen nicht zu Schwankungen im Messsignal. Die Verwendung des Pipettierroboters minimiert zudem die Gefahr von (menschlichen) Pipettierfehlern und Kontaminationen.

Die Form des Deckels der Multiwellplatte begrenzt das Volumen im Bereich der Zellkultur-Kavitäten auf wenige Mikroliter, was zu einer gesteigerten Sensitivität des Mediums gegenüber Ansäuerung und Sauerstoffverbrauch führt. Bevor die Sauerstoffvorräte im Messbereich zu stark verringert sind oder der pH-Wert den physiologischen Bereich verlässt, wird durch den Roboter frisches Medium zupipettiert.

Zellzahl und Morphologie in einem Experiment detektieren

Ein spezielles automatisiertes Inversmikroskop ermöglicht die bildgebende Dokumentation der Experimente (s. Abb. 3). Das Mikroskop wird über einen XY-Tisch bewegt, und kann somit jede Position auf der Multiwellplatte anfahren. Die Sensorplatte muss dazu nicht bewegt werden, wodurch Strömungsartefakte und mechanischer Stress für die Zellen verhindert werden. Das Mikroskop kann mit bis zu vier Objektiven ausgestattet werden, die automatisch gewechselt werden können. Diese bieten in der Regel eine zwei- bis vierzigfache Vergrößerung. Neben der Bildgebung werden auch die pH- und pO2-Sensoren durch das selbstfokussierende Mikroskop optisch ausgelesen. Die Abfolge der aufzunehmenden Positionen kann vom Benutzer für jedes Experiment festgelegt werden.

Die Impedanzmessung erfolgt über eine Platinstruktur von Elektroden im Substrat der Zellkultur. Mit ihr lässt sich die Bedeckung der Wells feststellen. Ebenfalls kann mittels Impedanzmessung die Stärke der Anhaftung der Zellen sowie Veränderungen in den Membranstrukturen detektiert werden. Die zur Durchführung der Impedanzmessungen notwendige Wechselspannung wird so gering gehalten, dass keine Beeinflussung der Zellen durch die Messung nachweisbar ist.

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Messung des Metabolismus von Zellen

Mit fluoreszierenden Sensor-Spots kann dann der pH-Wert und der Sauerstoffgehalt gemessen werden, ohne das Medium zu verändern oder anderweitig zu verbrauchen. Bei jedem Medienwechsel (in der Regel alle 20 Minuten) gehen pH-Wert und Sauerstoffgehalt wieder auf die im Medium eingestellten Werte zurück und ein neuer Messzyklus kann beginnen. Aus der Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs bzw. der Ansäuerung des Mediums kann auf die Stoffwechselaktivität der Zellen geschlossen werden.

Die Konzeption des IMR-Systems ist von vornherein auf eine möglichst automatische und damit reproduzierbare Durchführung von Experimenten ausgerichtet, Die Interaktion durch den Nutzer soll hierbei möglichst gering gehalten werden. Im Labor muss nur die Sensorplatte in einem gewöhnlichen CO2-Zellkulturschrank mit Zellen vorinkubiert, sowie Nährmedien und Wirkstoffe in Multiwellplatten vorgelegt werden.

Auch dieser Vorgang kann durch handelsübliche Handlingsysteme automatisiert werden. Bei Beginn des Experiments werden diese Platten in das System eingelegt und die Software mit dem vorher ausgewählten Versuchsablauf gestartet. Weitere Eingriffe des Benutzers sind dann nicht mehr notwendig. Bei Bedarf kann ein laufendes Experiment jedoch jederzeit abgeändert werden.

Beispiel: Chemosensitivität bei der Tumortherapie

In der Tumortherapie stellt sich beispielhaft oft die Frage, in welcher Konzentration bestimmte Medikamente bei einem Tumor die beste Wirksamkeit zeigen. Dafür wurden im IMR-System MCF-7-Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von Doxorubicin und Cisplatin behandelt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 4 zu sehen.

Es ist zu erkennen, dass die Zytostatika einen deutlichen Einfluss auf den Metabolismus haben, der von Wirkstoff und Konzentration abhängig ist. Die Messwerte zeigen über den Verlauf des Experimentes eine Abnahme der Metabolismusrate. Die Kontrolle ohne Wirkstoff zeigte eine gleichmäßige wachstumsbedingte Zunahme über den gesamten Versuch.

Das System wird derzeit mit verschiedenen Zelllinien wie beispielsweise MCF-7, L929 oder Caco 2 aber auch mit humanem Tumorproben, sowie immobilisierten Suspensionszellen (Hefen und Bakterien) getestet.

Es eignet sich durch die flexiblen Experimente und die unterschiedlichen Sensoren für eine Vielzahl an Anwendungen. Darunter fallen zum Beispiel Toxizitäts-, Chemosensitivitätstests, Medienoptimierung oder auch die Wirkstoffsuche in der Medikamentenentwicklung.

Literatur

[1] Bioelectrochemestry and Bioenergetics 1998; 46:215-225 Biofunctional hybrid structures – cell-silicon hybrids for applications in biomedicine and bioinformatics. Wolf B., Kraus M., Brischwein M., Ehret R., Baumann W. and Lehmann M.

[2] Lab Chip 2003; 3:234-240 Functional cellular assays with multiparametric silicon sensor chips. Brischwein M., Motrescu E.R., Cabala E., Otto A.M., Grothe H., and Wolf B.

[3] Med Bio Eng Comput 2007; 45:1023-1028 Automated live cell screening system based on a 24-well-microplate with integrated micro fluidics. Lob V., Geisler T., Brischwein M., Uhl R. and Wolf B.

*HP Medizintechnik GmbH, 85764 Oberschleißheim**Heinz-Nixdorf-Lehrstuhl für Medizinische Elektronik, TU München, 80333 München

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