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2D-Flüssigkeitschromatographie Neue Entwicklungen in der 2D-Flüssigkeitschromatographie

Autor / Redakteur: Thorsten Teutenberg*, Juri Leonhardt*, Jakob Haun*, Christoph Portner* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

In den letzten Jahren hat ein deutlicher „Hype“ im Bereich der 2D-Flüssigkeitschromatographie eingesetzt. Doch wo genau liegen für Forschungs- und Routinelabore die Stärken dieser neuen Technologie und wo besteht noch Entwicklungsbedarf?

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(Bild: IUTA)

In allen Bereichen der Life Sciences werden immer komplexere Proben analysiert. Dieser Trend macht auch vor der Umweltanalytik nicht halt. Waren vor etwa zehn Jahren die ersten Multimethoden auf die Erfassung weniger Zielanalyten ausgerichtet, so wird heute versucht, Hunderte von Komponenten und deren Metabolite bzw. Transformationsprodukte in einem analytischen Lauf zu erfassen [1]. Als Detektor der Wahl hat sich das Massenspektrometer etabliert.

Die Strategie besteht hier entweder in der selektiven Erfassung und Quantifizierung ausgewählter Zielanalyten mittels Tandemmassenspektrometrie oder in der Aufklärung komplexer Abbaumechanismen bei der Trinkwasseraufbereitung mittels Flugzeitmassenspektrometrie. Hierfür werden Massendetektoren mit hoher Datenaufnahmerate und der Möglichkeit zur präzisen Bestimmung der Summenformel benötigt.

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Diese Voraussetzung wird von modernen Flugzeitmassenspektrometern erfüllt. Durch die Nutzung der Q-Tof-Technologie können darüber hinaus Fragmentierungsexperimente durchgeführt werden, um eine Strukturcharakterisierung vorzunehmen.

Obwohl leistungsfähige massenspektrometrische Detektoren zur Verfügung stehen, bereitet die Matrix der Probe bzw. die Anzahl co-eluierender Substanzen häufig Probleme.

Insbesondere bei der Rückstandsanalytik von Pestiziden in verschiedenen Matrices kommt es zu deutlich ausgeprägten Signaleinbrüchen [2]. Diese Ionensuppression ist deshalb insbesondere bei Quantifizierungsmethoden ein großes Problem, aber auch bei der Detektion potenziell unbekannter Metabolite oder Transformationsprodukte. Komponenten, die in einer hohen Konzentration vorliegen, können somit das Signal der in niedriger Konzentration vorliegenden Stoffe vollkommen überdecken.

Flüssigchromatographie in zweiter Dimension

Vor diesem Hintergrund hat eine wahre Renaissance der chromatographischen Trenntechniken eingesetzt, um die Peakkapazität zu erhöhen und eine bessere Auftrennung zu ermöglichen. Eine Möglichkeit bietet die Anwendung der UHPLC, bei der Säulen mit kleinen Partikeln (kleiner 2 µm) eingesetzt werden, welche zu extrem hohen Drücken von bis zu 1000 bar führen [3]. Ein anderer Weg besteht in der Kopplung von zwei chromatographischen Trennsystemen über ein Modulationsventil, sodass das Eluat der ersten Trenndimension in fest definierten Zeitintervallen in einer Probenschlaufe aufgefangen und einer zweiten Trennsäule zugeführt wird [4]. Ein entsprechender Aufbau einer zweidimensionalen LC x LC-Kopplung ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt. Das Eluat aus der ersten Trenndimension wird kontinuierlich in das Modulationsventil geleitet, in dem sich zwei Probenschlaufen befinden.

Nach einer vorher definierten Sammelzeit wird das Ventil geschaltet, sodass das aufgefangene Eluat auf die zweite Trenndimension injiziert wird, während das aus der ersten Trennsäule nachströmende Eluat in der zweiten Probenschleife aufgefangen wird. Dieser Vorgang wiederholt sich so oft, bis alle Komponenten von der ersten Trenndimension eluiert sind.

Der Vorteil einer solchen zweidimensionalen LC x LC-Kopplung liegt darin, dass anhand unterschiedlicher Selektivitäten beider Trennsysteme, coeluierende Spezies auf der zweiten Trennsäule aufgetrennt werden können. Neben einer Erhöhung der Peakkapazität führt dies auch zu einem geringeren Risiko von Suppressionseffekten, wenn ein Massenspektrometer als Detektor verwendet wird.

Die Herausforderung bei dieser Kopplung besteht darin, eine extrem schnelle Gradiententrennung in der zweiten Trenndimension zu realisieren. Dies ergibt sich aus der kurzen Sammelzeit in den Probenschlaufen, welche die Laufzeit der zweiten Dimension definiert. Bei bereits kommerziell verfügbaren Lösungen im Bereich der LC x LC-Kopplung kommt es deshalb häufig zu dem Problem, dass eine hohe Flussrate von mehr als 2 mL min-1 in der zweiten Trenndimension resultiert, was die Kompatibilität mit der Elektrosprayionisation einschränkt. Vor diesem Hintergrund bestand der hier dargestellte Lösungsansatz darin, ein miniaturisiertes System bestehend aus einer Nano-HPLC in der ersten und einer Kapillar-HPLC in der zweiten Trenndimension einzusetzen.

Durch die Nutzung von Core-shell-Materialien sowie der Erhöhung der Temperatur kann die lineare Fließgeschwindigkeit in der zweiten Trenndimension erhöht werden, ohne dass eine hohe Gesamtflussrate resultiert. Dies ergibt sich aus der Tatsache, dass aufgrund der Temperaturzunahme die Viskosität der mobilen Phase und somit der Gegendruck herabgesetzt wird [5].

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Aufbau des LC x LC-Tof-MS-Systems und Analysen

Abbildung 2 zeigt den Aufbau des LC x LC-Tof-MS-Systems. Hierbei wurde auf ein kommerziell verfügbares 2D-LC-System von Eksigent zurückgegriffen, welches modifiziert und mit einem Tof-MS-System von AB Sciex gekoppelt wurde. Der Vorteil des Eksigent-Systems besteht in der kompakten Anordnung der beiden 10-Port-Ventile und der Pumpenausgänge, sodass beide Trennsäulen auf kürzestem Wege miteinander verbunden werden können. Um die Peakverbreiterung durch lange Kapillarwege bzw. -durchmesser zu minimieren, wurde die Erdung über einen Metallverbinder zur Elektrosprayquelle mittels Krokodilklemme realisiert und ein speziell für niedrige Flussraten ausgelegtes Emitter-Tip verwendet.

In Abbildung 3 ist das Totalionenstrom-Chromatogramm einer Pool-Staubprobe gezeigt.

Neben der Weiterentwicklung von analytischen Trenntechniken beschäftigt sich das Iuta sehr intensiv mit Fragestellungen aus der Innenraumhygiene. Hausstaub ist nicht nur eine komplexe Matrix, sondern dient auch als Passivsammler für mittel- bis schwerflüchtige Substanzen. Die Anreicherung dieser Stoffe aus Wohnräumen kann u.a. als Indikator herangezogen werden, ob eine mögliche Belastung der Bewohner durch toxische Substanzen vorliegt [6, 7].

Die Interpretation des in Abbildung 3 dargestellten TIC-Chromatogramms ist recht komplex, denn erst durch Dekonvolution in einzelne Massenspuren können alle Substanzpeaks dargestellt werden. Da es für die in diesem Beitrag beschriebene Kopplung keine herstellerseitige Softwarelösung gibt, zweidimensionale MS-Daten automatisch auszuwerten, wurde auf selbst erstellte Makros zurückgegriffen [8]. Anhand des TIC-Chromatogramms lassen sich jedoch erste Aussagen bezüglich der Retentionsmechanismen treffen.

In der ersten Trenndimension wurde eine Hypercarb-Säule verwendet, die aus reinem grafitisierten Kohlenstoff besteht. Diese bietet den Vorteil, dass auch polare Komponenten eine deutliche Retention erfahren. In der zweiten Trenndimension wurde eine Umkehrphase mit teilporösen Partikeln verwendet, um hohe lineare Fließgeschwindigkeiten zu erzielen.

Auffällig ist, dass die inverse Diagonale im Contour-Plot auf einen Unterschied in den Trennmechanismen der beiden stationären Phasen hinweist. Während die polaren Komponenten zu Beginn der Trennung in der zweiten Dimension zunächst keine Retention erfahren, kehrt sich dieser Mechanismus nach ca. 35 min um.

Komponenten, die auf der Hypercarb-Phase nur moderat retardiert werden, erfahren auf der RP-Säule plötzlich eine deutlich ausgeprägtere Retention. Im weiteren Verlauf der chromatographischen Trennung nimmt die Retention auf der RP-Phase dann wieder ab, während die Retention auf der Hypercarb-Phase zunimmt. Einen Erklärungsansatz hierfür bietet der sog. „Polar-Retention-Effect on Graphite“ [9].

Ausblick auf weitere Arbeiten und Danksagung

Die weiteren Arbeiten auf dem Gebiet der zweidimensionalen LC x LC-Kopplung werden sich schwerpunktmäßig mit der systematischen Evaluierung der Large-Volume-Injektion auf Kapillar- bzw. Nano-Trennsäulen beschäftigen. Hierbei haben sich bereits für die konventionelle LC-MS-Kopplung eingesetzte Säulenkombinationen analog dem von Bischoff vorgestellten POP-LC-Konzept bewährt [10].

Das Forschungsvorhaben 15928 N der Forschungsvereinigung IUTA wurde über die AiF im Rahmen des Programms zur Förderung der Industriellen Gemeinschaftsforschung und -entwicklung (IGF) vom Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie aufgrund eines Beschlusses des Deutschen Bundestages gefördert. Darüber hinaus danken wir AB Sciex und Herrn Sven Stuke von Bayer Crop Science für die Möglichkeit, Messungen am TripleTOF 5600 im Rahmen einer Demostellung durchzuführen. Julia Jasak danken wir für die freundliche Unterstützung und Hilfestellung bei der Kopplung des Eksigent-Systems mit dem Massenspektrometer. Herrn Dr. Maier-Rosenkranz von der Firma Grace danken wir für die Unterstützung bei der Anfertigung maßgeschneiderter Kapillarsäulen.

Literatur

[1] M. Krauss, H. Singer, J. Hollender, Analytical and Bioanalytical Chemistry 397 (2010) 943.

[2] H. Stahnke, T. Reemtsma, L. Alder, Analytical Chemistry 81 (2009) 2185.

[3] S.A.C. Wren, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 38 (2005) 337.

[4] P. Dugo, F. Cacciola, T. Kumm, G. Dugo, L. Mondello, Journal of Chromatography A 1184 (2008) 353.

[5] T. Teutenberg, S. Wiese, P. Wagner, J. Gmehling, Journal of Chromatography A 1216 (2009) 8470.

* Dr. T. Teutenberg, J. Leonhardt, J. Haun, Dr. C. Portner: Institut für Energie- und Umwelttechnik e.V., 47229 Duisburg

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