English China

Vielfarben-Mikroskopie Neue Mikroskopie bringt Farbe in die biomedizinischen Forschung

Autor / Redakteur: Anna Löschberger* / Dr. Ilka Ottleben

Bereits seit einem halben Jahrhundert erlaubt die Fluoreszenzmikroskopie die spezifische Darstellung zellulärer Strukturen und Gewebe. Würzburger Forscher haben nun eine Methode entwickelt, mit der sich neun und mehr verschiedene Zellstrukturen gleichzeitig markieren und abbilden lassen.

Firmen zum Thema

Abb. 2: Drei verschiedene Sonden (Phalloidin, Azid und Antikörper) wurden mit demselben Fluoreszenzfarbstoff (ATTO 488) markiert, wodurch drei Zellstrukturen sichtbar gemacht werden konnten: Das Aktin-Zellskelett (grün), die DNA im Zellkern (blau) und der so genannte Golgi-Apparat (magenta). Dieses Ergebnis hebt die extrem hohe Sensitivität des sFLIM-Verfahrens hervor.
Abb. 2: Drei verschiedene Sonden (Phalloidin, Azid und Antikörper) wurden mit demselben Fluoreszenzfarbstoff (ATTO 488) markiert, wodurch drei Zellstrukturen sichtbar gemacht werden konnten: Das Aktin-Zellskelett (grün), die DNA im Zellkern (blau) und der so genannte Golgi-Apparat (magenta). Dieses Ergebnis hebt die extrem hohe Sensitivität des sFLIM-Verfahrens hervor.
(Bild: modifiziert nach Niehörster et al., Nature Methods 2016 [1])

Der Lehrstuhl für Biotechnologie und Biophysik der Universität Würzburg hat eine Methode entwickelt, mit der sich neun verschiedene Zellstrukturen gleichzeitig markieren und abbilden lassen. Theoretisch sind sogar fünfzehn Markierungen oder mehr möglich. Die Voraussetzung hierfür ist eine äußerst präzise Zuordnung von Fluoreszenz-Signalen, welche die Forscher nun mittels spektral aufgelöster Fluoreszenz-Lebensdauer-Mikroskopie (sFLIM) erreichen.

Was ein Fluoreszenzmikroskop detektiert

Schon lange gehört die Fluoreszenzmikroskopie zu den gebräuchlichsten bildgebenden Verfahren in der biologischen Forschung. Um bestimmte Substrukturen in einzelnen Zellen oder spezielle Bereiche von Geweben bildlich darzustellen, werden mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelte Marker verwendet. Diese Sonden bleiben dann z.B. an Proteinen, Fetten oder der DNA haften und können mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops abgebildet werden. Für den Biologen werden dadurch verborgene Strukturen, wie z.B. das formgebende Zellskelett, die Hülle des Zellkerns oder Bereiche neu entstehender DNA sichtbar.

Bildergalerie

Bei Fluoreszenzmikroskopie denken die meisten automatisch an die klassische Fluoreszenzmikroskopie, bei der die Fluoreszenzintensität gemessen und Farbstoffe spektral (nach Farben) voneinander getrennt werden. Je nach Mikroskop-Ausstattung lassen sich damit Ein- oder Mehrfarben-Experimente durchführen, wodurch eine entsprechende Anzahl an Strukturen in einer Zelle oder einem Gewebeschnitt dargestellt werden kann. „Eine Schwierigkeit ist die eindeutige Unterscheidung von vielen verschiedenen fluoreszierenden Sonden, wenn sie sich teilweise sehr ähnlich sind“, sagt Thomas Niehörster, Doktorand bei Professor Sauer am Würzburger Biotechnologie-Lehrstuhl. Die Menge an möglichen Farben ist dadurch begrenzt und beeinflusst auch die Komplexität und die Kosten des Mikroskops.

Eine andere Fluoreszenz-Eigenschaft macht sich die Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (FLIM) zu nutze. Hierbei werden Fluoreszenzfarbstoffe nicht anhand ihrer unterschiedlichen Emissionsspektren (Farben), sondern anhand ihrer charakteristischen Fluoreszenzlebensdauer unterschieden (s. LP-Info).

Ergänzendes zum Thema
LP-Info: Von Farbstoffen und Lebensdauern

Werden Fluoreszenzfarbstoffe mit Licht angeregt, fluoreszieren sie, das heißt sie geben nun selbst Photonen (Licht) einer bestimmten Wellenlänge ab. Diese Emission von Licht ist ein gutes Unterscheidungsmerkmal dieser Farbstoffe, da sie eine spektrale (farbliche) Auftrennung ermöglicht. Als Fluoreszenzlebensdauer eines Farbstoffs bezeichnet man die mittlere Zeit, die er nach der Anregung auf einem höheren Energieniveau verbleibt, bevor er unter Abgabe eines Photons wieder in den Grundzustand zurückkehrt.

Das Unternehmen Picoquant, mit dem die Würzburger Forscher regelmäßig in Projekten kooperieren, ist auf zeitauflösende Methoden wie FLIM spezialisiert.

sFLIM nutzt Spektrum und Lebensdauer von Farbstoffen

Um möglichst viele Moleküle markieren und unterscheiden zu können, kombinieren die Wissenschaftler in ihrem neuen Verfahren nun die spektrale Fluoreszenzmikroskopie mit der Messung von Fluoreszenzlebensdauern. Die so genannte spektral aufgelöste Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (sFLIM) vereint hierbei die Vorteile beider Techniken und überwindet gleichzeitig Nachteile herkömmlicher Systeme hinsichtlich Empfindlichkeit, Geschwindigkeit und Auflösung. Zur Anregung der fluoreszenzmarkierten Sonden verwenden die Wissenschaftler drei abwechselnd gepulste Laser mit verschiedenen Wellenlängen (blau, grün, rot). Neben Unterschieden im Emissionsspektrum bestimmen sie mithilfe eines speziellen Detektors gleichzeitig die Fluoreszenz-Lebensdauer der Farbstoffe, die sich im Bereich von wenigen Nanosekunden bewegt. „Für jeden Farbstoff ergibt sich somit ein Pattern, also eine Art spezifisches Eigenschaftsmuster, wodurch er sich eindeutig von anderen Farbstoffen abgrenzt“, erklärt Niehörster. Den Forschern gelang es, je Laser fünf Fluoreszenzsonden zu unterscheiden, sodass theoretisch 15 Ziele gleichzeitig darstellbar wären. Der limitierende Faktor war letztlich nicht mehr die Auswahl an Farbstoffen, sondern die Verfügbarkeit an biologischen Sonden. Unter diesen Umständen gelang eine Aufnahme mit neun Farben, bei welcher unterschiedliche Zellstrukturen markiert wurden (s. Abb. 1).

Um die relativ komplexen Daten analysieren zu können, kooperierten die Würzburger mit der Arbeitsgruppe von Professor Enderlein aus Göttingen, welche maßgeblich an der Softwareentwicklung beteiligt war. Das Ergebnis dieser Zusammenarbeit kann sich sehen lassen: Das neue Verfahren funktioniert zuverlässig und ermöglicht laut Professor Sauer „eine Zuordnung der fluoreszierenden Sonden mit bislang unerreichter Genauigkeit.“ So können bereits kleinste Unterschiede mit sFLIM detektiert werden. Zu den beeindruckendsten Ergebnissen gehört eine Färbung, bei der drei Zellstrukturen mit nur einem einzigen Farbstoff unterschieden werden können. Wird dieser an drei verschiedene Sonden gekoppelt, sind die aus der Kopplung resultierenden Unterschiede ausreichend, um drei spezifische Pattern ausfindig zu machen und somit die Strukturen der Zelle bildlich darzustellen (s. Abb. 2).

Neue Möglichkeiten für die molekulare Medizin

Das Potenzial von sFLIM eröffnet auch der molekularen Medizin neue Perspektiven. Durch das multiplexe Markieren von Proben können viele Zielmoleküle gleichzeitig beobachtet und analysiert werden. Das könnte zukünftig sowohl in der medizinischen Diagnostik (z.B. bei der Beurteilung von Gewebebiopsien) als auch in der biochemischen Zellanalytik eine Rolle spielen.

Die hohe Sensitivität des Verfahrens erlaubt es in Zukunft auch, durch Hintergrundsignale ausgelöste Analyse-Probleme leichter zu beheben. Insbesondere bei Geweben ist die Eigenfluoreszenz der Probe ein häufig auftretendes Problem, welches vor allem die Detektion niedrig konzentrierter Zielmoleküle erschwert oder gar zu falsch-positiven Signalen führt. Die Pattern-Analyse von sFLIM ermöglicht es künftig, den Hintergrund mit hoher Genauigkeit und minimalem Verlust von echtem Signal zu trennen.

Das neue Verfahren lässt sich des Weiteren bereits sehr gut mit der hochauflösenden STED-Mikroskopie [2] kombinieren, für die der deutsche Physiker Stefan Hell 2014 mit dem Chemie-Nobelpreis ausgezeichnet wurde. Den Physikern bei Picoquant gelang es an einem STED-Aufbau zu zeigen, dass das neue Verfahren eine optimale Möglichkeit bietet, die Fluoreszenzsignale sauber zu trennen (s. Abb. 3). Somit wird es zukünftig auch in der hochauflösenden Mikroskopie leichter werden, verschiedene Strukturen gleichzeitig zu analysieren.

Entwicklungserfolg von Wirtschaft und Wissenschaft

sFLIM ist das Ergebnis einer erfolgreichen Kooperation des Würzburger Lehrstuhls für Biotechnologie und Biophysik mit der Universität Göttingen (Software) und des Berliner Unternehmens Picoquant (Hardware-Aufbau). Die Methode wurde kürzlich im Fachmagazin „Nature Methods“ veröffentlicht [1]. Ermöglicht wurde das Projekt unter anderem durch Fördergelder des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF).

Literatur

[1] Thomas Niehörster, Anna Löschberger, Ingo Gregor, Benedikt Krämer, Hans-Jürgen Rahn, Matthias Patting, Felix Koberling, Jörg Enderlein und Markus Sauer. Multi-target spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy. Nature Methods (2016), doi:10.1038/nmeth.3740; http://www.nature.com/nmeth/journal/v13/n3/full/nmeth.3740.html

[2] Hell, Stefan W.: Neues Gesetz zur Auflösung in der Lichtmikroskopie ermöglicht Bilder in bisher unbekannter Schärfe, Forschungsbericht 2005 - Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie, http://www.mpibpc.mpg.de/327643/research_report_815357

* Dr. A. Löschberger: Lehrstuhl für Biotechnologie und Biophysik, Biozentrum der Universität Würzburg, 97074 Würzburg

(ID:43971286)