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Probenvorbereitung in der Mikroskopie Ohne langes Warten: Lösemittelfreie Schnelleindeckmittel

Autor / Redakteur: Dusko Kadijevic* und Marcus Brückner** / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Eindeckmittel werden in den Bereichen der Histologie, Immunologie und Zytochemie, benötigt, um biologische Proben für die Mikroskopie zu fixieren und für einen längeren Zeitraum haltbar zu machen. Weche Vorteile bringt ein lösemittelfreies Eindeckmittel?

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Abb.1a: Einbringen der mit Eukitt UV-beaufschlagten Präparate in einen UV-Ofen, vor und während der Belichtung mit UV-Licht.
Abb.1a: Einbringen der mit Eukitt UV-beaufschlagten Präparate in einen UV-Ofen, vor und während der Belichtung mit UV-Licht.
(Bild: Orsatec)

Das so genannte Eindecken ist der letzte Schritt bei der Präparation für histologische Untersuchungen. Üblicherweise werden dabei Proben, z.B. Gewebe- oder Blutproben oder Zellen, zunächst auf einen Objektträger gebracht und dann mit einem Deckglas abgedeckt. Damit Objektträger und Deckglas sich nicht gegeneinander verschieben können, wird das Deckglas mit einem Eindeckmittel auf dem Objektträger fixiert. Dies verbessert zum einen die Handhabbarkeit. Zum anderen kann die fixierte Probe für viele Jahre aufbewahrt werden, ohne dass es zur Zersetzung kommt, da die Probe in das Eindeckmittel eingebettet ist und somit vor Feuchtigkeit, Sauerstoff und Lichteinwirkung geschützt wird.

Automatisierte Eindeckung von Präparaten

In der Anfangszeit wurden hier Eindeckmittel verwendet, die sehr lange Aushärtungszeiten benötigten, beispielsweise das transparente Baumharz Kanadabalsam [1].

Die Entwicklung von schnell aushärtenden Eindeckmitteln in den 50er Jahren des letzten Jahrhunderts hat es mit ermöglicht, dass sich die Bearbeitung von histologischen Proben zur Diagnose im medizinischen Bereich mittlerweile stark automatisiert und somit deutlich beschleunigt hat [2]. Hierzu werden heute so genannte Eindeckautomaten verwendet, die eine hohe Präzision und einen vielfach höheren Durchsatz generieren können, als das beim manuellen Eindecken möglich wäre. Auf diese Weise kann heute eine deutlich höhere Probenanzahl bearbeitet werden, als das in der Vergangenheit der Fall war, obwohl sich an der eigentlichen histologischen Technik in den letzten Jahrzehnten nicht viel geändert hat.

Eines der Gold-Standard-Eindeckmittel für das schnelle Fixieren ist Eukitt, das beispielhaft für ein Kunstharz-Xylol-basiertes Eindeckmittel steht. Bei den heutigen Standardsystemen beruht die Aushärtung auf dem eingesetzten Polymer, das im Lösemittel gelöst vorliegt und nach dem Verdunsten des Lösemittels beim Aushärten physikalisch erstarrt. Die Vorteile zu Kanadabalsam liegen in einer deutlich höheren Transparenz und der sehr hohen Aushärtungsgeschwindigkeit von ca. 20 Minuten. In den vergangenen Jahrzehnten haben sich sehr viele ähnliche Produkte im Markt etabliert. Sie werden heute in allen Bereichen der Histologie und Biologie verwendet. Xylol hat sich dabei als Lösemittel bewährt, da es für diese Anwendung sowohl hinsichtlich des Dampfdrucks als auch der Penetrationseigenschaften ins Gewebe ideal ist. Daneben gibt es Eindeckmittel auch auf Basis von Toluol und Petrolethermischungen, sowie das aus Schalen von Zitrusfrüchten gewonnene (R)-Limonen.

Mittlerweile wurden Xylol und seine Isomere in die so genannte CoRAP-Liste der ECHA aufgenommen, da es verdächtigt wird, sensibilisierend und als CMR-Stoff zu wirken [4]. Dies könnte mittelfristig dazu führen, dass Xylol und auch andere heute allgemein gebräuchliche organische Lösemittel zukünftig nicht mehr für alle Anwendungen eingesetzt werden dürfen. Da viele organische Lösemittel nicht nur gesundheitsschädlich oder umweltgefährdend sind, sondern auch brennbar, können sie mit Luftsauerstoff explosionsfähige Gemische bilden. Bei maschineller Verarbeitung müssen hier aufwändige Maßnahmen zum Explosionsschutz ergriffen werden.

Seit einigen Jahren gibt es auch Eindeckmittel auf Wasserbasis, die wasserlösliche Harz-Zusammensetzungen als Eindeckkomponente verwenden. Wässrige Eindeckmittel werden besonders für Präparate, bei denen ein Enzym oder Lipidnachweis durchgeführt wurde, verwendet, also Präparate, die nicht über eine aufsteigende Alkoholreihe entwässert wurden. Allerdings werden diese Produkte aufgrund der hohen Polarität von Wasser und der längeren Trocknungszeiten kaum in der Schnelleindecktechnik eingesetzt.

Einen großen Nachteil haben alle lösemittelbasierten Systeme: Durch das Verdunsten des Lösemittels verliert das System an Volumen – es kommt zu Schrumpf. Eine mögliche Folge ist Blasenbildung im Präparat. Gegebenenfalls ist das sehr aufwändig hergestellte Präparat (die Präparationsschritte können zwischen ein und fünf Tagen beanspruchen) ungeeignet für die mikroskopische Untersuchung. Es wird somit unbrauchbar [5].

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UV-Licht-härtende Systeme als Alternative

Die neu entwickelten Systeme beruhen auf UV-Licht-gestarteten Polymerisationen von reaktiven Acrylaten zu Poly­acrylaten. Derartige Systeme sind schon lange Zeit in verschiedenen Bereichen der Technik bekannt. Das Ziel der Forschung war es, ein System zu entwickeln, das für Mensch und Umwelt unbedenklich ist und wie bisher zum Eindecken verwendet werden kann. Somit kamen hochreaktive monomere Verbindungen wie Methacrylsäureester oder ähnliche Derivate nicht in Betracht, da diese Verbindungen sehr flüchtig und gesundheitsschädlich sind.

Die Lösung bestand in einer „Vorpolymerisation“ zu so genannten Prepolymeren. Dabei werden die Monomere vorab zu größeren Einheiten oligomerisiert, ohne eine komplette Vernetzung durchzuführen. Diese Vorpolymerisation wird bereits in der Produktion durchgeführt und führt zu Molmassen von 450 – 1200 g/mol. Die oligomeren Moleküle haben aufgrund der Molekülmasse nun praktisch keine Flüchtigkeit mehr. Ein weiterer Vorteil der Vorpolymerisation ist, dass der größte Teil der bei der Polymerisation frei werdenden Reaktionsenergie in Form von Wärme schon während der Produktion abgeführt werden kann.

Um unter dem Einsatz dieser Oligomerisierungstechnik ein einsetzbares Eindeckmittel zu entwickeln, war es weiterhin notwendig, Moleküle herzustellen, die eine gute und vor allem schnelle Penetrationswirkung in das Gewebe ermöglichen, da ohne Lösemittel auch die so genannten Transporter durch die Gewebeschichten fehlen. Daher mussten Oligomere synthetisiert werden, die von Größe und Polarität leicht durch die Membranen und Zellwände von teilentwässertem Gewebe diffundieren können. Nach zahlreichen Experimenten haben sich hier oligomere Urethanacrylate mit gesättigten und ungesättigten Seitenketten als am besten geeignet gezeigt. Zudem lässt sich die gewünschte Viskosität des Systems sehr einfach einstellen.

Um die Oligomere nach der Penetration in das Gewebe, die ca. zwei Minuten dauert, durch radikalische Polymerisation auszuhärten, wird ein Photoinitiator benötigt, der im Eindeckmittel Eukitt UV bereits integriert ist. Diese Photoinitiatoren haben sich bereits über Jahre hinweg in UV-härtenden Nagellacksystemen bewährt und wurden dort auch auf ihre Verträglichkeit für Mensch und Umwelt untersucht [6]. Die Bestrahlung mit einer handelsüblichen UV-Licht-Quelle und die dabei erfolgende Aushärtung dauert ca. 30 Sekunden – der Brechungsindex des so erhaltenen Polymers beträgt 1,48. Ein kompletter Eindeckvorgang benötigt maximal zweieinhalb Minuten, was bei heute in Deutschland zwischen 50 und 60 Millionen angefertigten Gewebeschnitten im klinisch-medizinischen Bereich eine erhebliche zeitliche Reduktion darstellen könnte [7].

Ein weiterer Vorteil dieses Systems ist es, dass die letzten Spül­schritte vor dem Eindecken mit Xylol entfallen könnten, da das UV-System Alkohole toleriert. Aus diesem Grund erreicht man nicht nur eine deutliche Zeitersparnis beim Aushärten des Eindeckmittels, sondern auch eine Verkürzung der gesamten Prozesskette. Ein wichtiges Kriterium zur breiten Anwendbarkeit eines Eindeckmediums stellt die Möglichkeit dar, ein bereits eingedecktes Präparat im Bedarfsfall erneut vom Deckglas und vom Eindeckmedium zu befreien und nachfärben zu können.

Eukitt UV kann nach der UV-Licht-gestarteten Polymerisation sehr einfach in Aceton, Eisessig oder DMSO entfernt werden. So kann das Präparat neu gefärbt und anschließend wieder eingedeckt werden.

Experimenteller Teil und histologische Ergebnisse

Histologische Mikrotomschnitte von Leber-, Nieren- und Gehirngewebe wurden mittels HE- und Toluidin gefärbt und mit Eukitt UV eingedeckt. Die Präparate wurden für die Dauer von 14 Tagen alle zwei Tage mikroskopisch kontrolliert und dokumentiert. Zusätzlich wurden zwei überfärbte Präparate eingedeckt, um mögliche Einflüsse von Eukitt UV auf den Farbstoffüberschuss zu untersuchen. Als Referenzen wurden die gleichen Präparate mit den etablierten Eindeckmitteln Eukitt neo und Leica CV Ultra eingedeckt und untersucht.

Die mit Eukitt UV eingedeckten Präparate zeigten über den gesamten Untersuchungszeitraum weder eine Veränderung bezüglich der Gewebemorphologie noch der Färbungsintensität. Während der täglichen Untersuchungen konnten außerdem keine Artefakte wie Blasenbildung etc. festgestellt werden.

Ausblick: Integration in die automatisierte Eindecktechnik

Die nächsten Schritte bei der Einführung von UV-härtenden Eindeckmitteln in die Laborpraxis bestehen in der Integration der Technologie in die automatisierte Eindecktechnik und die Überzeugung der Anwender von der neuen Klasse der Schnell­eindeckmittel.

Literatur

[1] U. Welsch, Lehrbuch Histologie, 2014, 4. Auflage, Elsevier, München.

[2] H.-C. Burck, Histologische Technik, 1988, 6. Auflage, Thieme-Verlag, Stuttgart.

[3] H.-C. Burck, Histologische Technik, 1988, 6. Auflage, Thieme-Verlag, Stuttgart.

[4] 2016: https://echa.europa.eu/information-on-chemicals/evaluation/community-rolling-action-plan/corap-table

[5] J. A. Kiernan, Histological and histochemical Methods, 2008, 4th Edition, Scion Publishing.

[6] J.-P. Fouassier, J. Lalevee, Photoinitiators for Polymer Synthesis, 2012, Wiley-VCH, Weinheim.

[7] 2016, Homepage: http://www.pro-patho.de/blog/files/archive-aug-2014.html; Pro-Patho GmbH, 2014.

* D. Kadijevic: Orsatec GmbH, 86399 Bobingen

* *M. Brückner: Brückner Material Sciences & Histology, 68163 Mannheim

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