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Sensorüberwachung Optosensorische Permanentüberwachung der Sauerstoff- und pH-Kinetik

Autor / Redakteur: Karin Benz* und Jürgen Mollenhauer* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Die Sauerstoffkonzentration und die Kinetik des pH-Werts zählen in der erfolgreichen In-Vitro-Kultiverung und Differenzierung von Zellen zu den Schlüsselfaktoren. Eine Permanentüberwachung dieser Parameter ist insbesondere dann entscheidend, wenn eine lichtmikroskopische Überwachung der Kulturqualität und der morphologischen Differenzierung nur schwer möglich ist – so in 3D-Zellkultursystemen auf Hydrogelbasis.

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Die autologe Knorpelzelltransplantation (ACT) ist eine neue experimentelle Therapie zur Behandlung degenerativer Bandscheibenerkrankungen. Mit ihr erscheint in naher Zukunft selbst die Reparatur von Bandscheibenschäden möglich. Allerdings gilt zu bedenken, dass die Sauerstoffkonzentration im Bandscheibenkern unter In-Vivo-Bedingungen sehr gering ist und die verwendeten Chondrozyten durch Übertragung in normoxische Kulturbedingungen Schaden nehmen können. Sensible Prozesse der In-vitro-Zellvermehrung und -differenzierung laufen nur bei strikter Einhaltung exakt definierter Kulturparameter ab. Knorpelzellen funktionieren in Gelmatrix bedeutend besser als in Monolayerkulturen, da hier das physiologische Umfeld den Gegebenheiten in der Bandscheibe deutlich mehr entspricht (s. Abb. 1). Exakte Messungen des Sauerstoffverbrauchs in der Kultivierung erlauben es, Rückschlüsse auf den metabolischen Zustand der Zellen und die Qualität der Kulturbedingungen zu ziehen. Diese beiden Kulturparameter konnten bislang allerdings – vorwiegend aufgrund des Fehlens der notwendigen Miniaturisierungstechnik – nicht dauerhaft überwacht werden. Das optosensorische Messsystem SDR von PreSens macht jetzt die nichtinvasive Messung beider Kulturparameter unmittelbar an den Zellen möglich.

Nichtinvasive Überwachung

Die kinetische Charakterisierung des gelösten Sauerstoffs und des pH-Werts erfolgte nach einem bewährten 3D-Kulturverfahren. Drei verschiedene Zelldichten (0,1, 0,5 und 1 x 106 Zellen/ml) wurden über ca. zwei Wochen hinweg in einer proprietären Hydrogelmatrix in Oxodish bzw. Hydrodish kultiviert. Jede Kavität enthielt 2 ml eines gepufferten Kulturmediums mit einem pH-Wert von 7,4. Während der Studie wurde dieses Medium sowohl in den zellhaltigen Proben wie auch in den Kontrollen drei Mal (am 2., 5. und 8. Tag) gewechselt. Die Permanentüberwachung wurde kurz nach Aussäen der Zellen gestartet. Am 6. und 9. Tag erfolgte eine optische Kontrolle, für die die Multidish-Platten kurzzeitig aus der normalen Inkubatoratmosphäre mit fünf Prozent CO2 und 95 Prozent rel. Feuchte geholt wurden. Die Sauerstoffkinetik wurde durch Berechnung des Durchschnitts aus drei Replikaten je Zelldichte ermittelt. Zellfreie Kulturen dienten als Vergleich. Die Proben mit der höchsten Dichte zeigten den größten Sauerstoffverbrauch und entsprechend die niedrigste Konzentration an gelöstem Sauerstoff (DO) im Kulturmedium (s. Abb. 2). Die gezeigte DO-Kinetik entspricht jeweils dem Durchschnitt dreier Einzelmessungen der drei Zelldichten 0,1, 0,5 und 1 x 106 Zellen/ml. Pfeile markieren den Wechsel des Kulturmediums, Sternchen die kurzzeitige Herausnahme der Kultur aus dem Inkubator. Die oberste Linie in Abbildung 2 zeigt die DO-Kinetik zellfreier Kontrollproben zum Vergleich. Beim Wechsel des Kulturmediums stieg die DO-Konzentration je nach vorhergehender Equilibrierung des Mediums wieder auf annähernd den Ausgangswert von 14 bis 16 Prozent Sauerstoff an. Abhängig von der metabolischen Aktivität der Probe fiel der Sauerstoffgehalt schon nach kurzer Zeit wieder auf einen neuen Tiefstwert ab. Nach Erreichen des Tiefpunkts stieg die DO-Konzentration dann in allen Proben wieder an. Der Grund hierfür ist vermutlich in einer starken Abnahme der metabolischen Aktivität zu suchen, da in Knorpelzellen der Crabtree-Effekt (Drosselung des Stoffwechsels statt Gärung wie bei anderen Zelltypen) auftritt. Zusätzlich dazu wird die Sauerstoffkinetik von weiteren komplexen Faktoren beeinflusst, darunter auch von der Zellvermehrung. In der Probe mit 0,5 Millionen Zellen/ml war bereits nach dem zweiten Wechsel des Kulturmediums eine ausgeprägtere Abnahme der Sauerstoffkinetik festzustellen als in der Probe mit der anfänglich höchsten Zelldichte, was auf eine höhere metabolische Aktivität hindeutet. Folglich führt die Steigerung der Zelldichte zu einer Verringerung der metabolischen Aktivität.

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