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GC/MS-basierte Frühwarnsysteme Per VOC-Messung tückische Krankheitserreger bei Pflanzen aufspüren

Autor / Redakteur: Guido Deußing* / Dr. Ilka Ottleben

Lange bevor Pflanzen Krankheitssymptome zeigen, können sie von epidemischen Erregern befallen sein. Um eine Ausbreitung von Schaderregern wie Phytophthora ramorum durch infizierte, asymptomatische Pflanzen zu verhindern, braucht es geeignete Frühwarnsysteme. Ein neues GC/MS-basiertes Diagnoseverfahren, das von den infizierten Pflanzen emittierte flüchtige organische Verbindungen (VOC) misst, könnte hier ein vielversprechender Ansatz sein.

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Der Rhododendron gilt als eine der typischen Wirtspflanzen des Schaderregers Phytophthora ramorum.
Der Rhododendron gilt als eine der typischen Wirtspflanzen des Schaderregers Phytophthora ramorum.
(Bild: HildaWeges hilda.weges@chello.nl - stock.adobe.com)

Mitte der 1990er-Jahre begann in Kalifornien ein großes Baumsterben. Vom plötzlichen Eichentod (Sudden Oak Death, SOD) war die Rede, fielen doch der Seuche vor allem Eichen zum Opfer. Als ursächlich für das Baumsterben wurde der Schaderreger Phytophthora ramorum identifiziert, ein pilzähnlicher Mikroorganismus, der verschiedene Sporenarten ausbildet, die mit Wind und Regentropfen verbreitet werden. Dringen die keimenden Sporen in Baumrinden und Blätter ein, zerstören sie die Pflanzenzellen. In der Folge kommt es zu einer Verfärbung von Blättern und Trieben oder auch zum Absterben ganzer Bäume.

Wie breitet sich Phytophthora ramorum aus und warum ist der pflanzliche Schaderreger so gefährlich?

  • Die Verbreitung von P. ramorum geschieht in aller Regel über kontaminierte Erde, über das Wasser und mit infizierten Pflanzen selbst.
  • In Europa wurde der Erreger insbesondere bei Zierpflanzen entdeckt, weshalb man in diesem Zusammenhang auch von der Baumschulkrankheit spricht. Der Rhododendron gilt als eine der typischen Wirtspflanzen.
  • Begünstigt wird die Verbreitung von P. ramorum dadurch, dass selbst gesund aussehende Pflanzen den Erreger in sich tragen können.
  • Problematisch ist: Symptome der Erkrankung werden oft erst dann sichtbar, wenn infizierte Pflanzen bereits verkauft oder weitertransportiert worden sind.

Frühwarnsysteme sollen Risiko einer unkontrollierten Ausbreitung eindämmen

Um das Risiko einer unkontrollierten Ausbreitung von P. ramorum einzudämmen, haben sich US-amerikanische Wissenschaftler auf die Suche nach einer Methode gemacht, die es ermöglicht, den Erreger auf einfache Weise frühzeitig, also auch bei infizierten, asymptomatischen Pflanzen zu bestimmen. Den Ansatz, den Mitchel M. McCartney et al. [1] verfolgten, fußt auf der Annahme, dass die Pflanze auf physiologischer Ebene auf eine Infektion reagiert, und zwar durch Veränderung der Zusammensetzung ihrer sekundären flüchtigen Pflanzenmetaboliten. Diese lassen sich unter dem Oberbegriff biogene flüchtige organische Verbindungen (VOCs) subsummieren und mittels GC/MS bestimmen.

Schwierigkeit der bisherigen Analyse auf Phytophthora ramorum

Die Bestimmung von P. ramorum erweist sich als Herausforderung, schreiben Mitchel M. McCartney et al. Ein bis zwei Jahre könne es dauern, bis eine infizierte Pflanze krankheitstypische Symptome zeige. Jahreszeitliche, klimatische und physiologische Bedingungen würden zudem Einfluss nehmen und eine eindeutige Zuordnung erschweren. Je nachdem, wo sich die Erreger befinden, etwa im Bereich der Wurzeln, könnten einordnende Symptome auch gänzlich ausbleiben. Nicht in der Lage zu sein, den Befall einer Pflanze zu erkennen, kann sich als Risiko erweisen für Gärtnereien, Baumschulen und deren Kunden und verkompliziere alle regulatorischen Bemühungen, eine Ausbreitung des Keims sowie den Krankheitsausbruch zu verhindern.

Kritisch betrachten Mitchel M. McCartney et al. bisher genutzte Bestimmungsmethoden, etwa den Versuch, den Keim durch Abdecken von Wurzel- und Blattproben oder Blattkörpern auf Phytophthora-selektiven Medien zu isolieren, was einige Tage und länger in Anspruch nehme, bis verwertbare Resultate vorlägen; diese könnten zudem variieren, je nach Wirtspflanze und Zeit, die zwischen Probenahme und Analyse verstreicht. Die Autoren beleuchten in ihrer Arbeit den Einsatz von Immunoassays, die i.A. zwar schnell, empfindlich und zuverlässig Auskunft gäben, allerdings auch nur dann, wenn Wirtspflanzengewebe untersucht würde, das pathogene Zellen aufweise. Ähnlich verhalte es sich mit der Bestimmung pathogener Nukleinsäuren mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR); auch sie setzt das Vorhandensein des Keims voraus.

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Mitchel M. McCartney et al. präferierten für ihre Untersuchung eine andere Vorgehensweise. Sie berücksichtigt Veränderungen der Biochemie von Pflanzen, wenn sie z.B. von Insekten attackiert oder im Zuge abiotischer Umweltfaktoren verletzt und in Mitleidenschaft gezogen würden. Der Stress, den die Pflanzen hierbei erfahren, hat Einfluss auf den Pflanzenstoffwechsel und dessen Endprodukte. Die Wissenschaftler verweisen mit Blick auf die Fachliteratur darauf, dass die Bestimmung biogener VOCs, die lebende Organismen verströmen, auch der Krankheitsdiagnostik diente. Dies böte die Möglichkeit einer nichtinvasiven in-situ-Technik, mit der sich eine Infektion bereits detektieren ließe, noch bevor sich erste Krankheitssymptome zeigten, mutmaßen Mitchel M. McCartney et al.

Davon ausgehend, dass P. ramorum nicht nur die Pflanze befällt, sondern sich auch im Boden und im Wasser finden lässt, wählten die Wissenschaftler ein umfangreiches Versuchsdesign mit drei verschiedenen Extraktionsvorgängen auf unterschiedlichen Ebenen, um ein Maximum an Informationen aus der Messung zu gewinnen.

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Kombination verschiedener Extraktionstechniken

Für ihre Untersuchung verwendeten Mitchel M. McCartney et al. getopfte Rhododendron-Hybride Cunninghams White, ein für P. ramorum anfälliges, weltweit gehandeltes Blütengewächs. Sie untersuchten gesunde sowie mit P. ramorum geimpfte und mit inaktivierten Erregern scheingeimpfte Pflanzen. Die Extraktion der VOCs erfolgte auf unterschiedlichen Niveaus und mit verschiedenen Techniken.

Um zu erfahren, welche Emissionen die Pflanze auf natürliche Weise abgibt, wurden Ast- und Blattwerk mit einem Kunststoffbeutel aus Polytetrafluorethen (PTFE) umhüllt. Im Inneren des Beutels wurden als Extraktionsmedium drei mit Polydimethylsiloxan (PDMS) ummantelte Twister (Gerstel) fixiert. Diese Extraktionstechnik wird als Headspace-Sorptive-Extraction (HSSE) bezeichnet (s. LP-Info-Kasten).

Ergänzendes zum Thema
LP-Info: Von HSSE, SBSE und HS-SPME

Die Headspace Sorptive Extraction (HSSE), deren Funktionsprinzip der Headspace Solid Phase Micro Extraction (HS-SPME) ähnelt, basiert auf der Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE). Bei der HSSE erfolgt die Extraktion allerdings nicht mit einer von außen beschichteten Faser, sondern es kommt die Twister-Technologie (Gerstel) zur Anwendung, die sich u. a. durch ein deutlich größeres Phasenvolumen und damit über eine weit höhere Anreicherungskapazität auszeichnet. Der Twister ist, vereinfacht gesagt, ein Rührstäbchen für Magnetrührer, das mit einer Sorptionsschicht – im vorliegenden Beispiel Polydimethylsiloxan (PDMS) – ummantelt ist und das im Dampfraum des Vials oberhalb der Probe befestigt werden kann. Nach der Extraktion erfolgt die Thermodesorption der im PDMS sorbierten Analyten in der Thermal-Desorption-Unit (Gerstel-TDU) und direkt anschließend die GC/MS-Analyse. Die TDU-GC/MS-Analyse lässt sich vollständig automatisieren.

Als zweite Technik kam die klassische SBSE zum Einsatz: Rhododendron-Blätter wurden in Stücke geschnitten und in Methanol gegeben. Anschließend wurden die Blätter entnommen und der Lösung zwei Twister-Rührstäbchen zugesetzt, die die in Methanol gelösten VOCs extrahierten. „Charakteristisch für den Twister ist sein gegenüber der SPME-Faser sehr großes Phasenvolumen, wodurch eine bis zu tausendfach größere Empfindlichkeit gegenüber der SPME resultiert“, sagt Oliver Lerch. Inzwischen stünden für die SBSE verschiedene Twister mit unterschiedlichen Phasen zur Verfügung, berichtet der promovierte Chemiker und Applikationsexperte von Gerstel, mit denen sich eine große Bandbreite unterschiedlich polarer Verbindungen höchst sensitiv extrahieren und sowohl mittels Thermodesorptions-Gaschromatographie (TD-GC/MS) als auch mittels Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC/MS) bestimmen ließen.

Schließlich und endlich wurden die Rhododendron-Gewächse gegossen, genauer gesagt, das Erdreich gewässert und auf diese Weise extrahiert. Aus dem aufgefangenen Durchfluss wurden wenige Milliliter entnommen und unmittelbar für eine Solid Phase Micro Extraction (SPME) verwendet.

Kontamination mit Schaderreger erkennbar

Sämtliche Proben aus allen Extraktionen wurden mittels Gaschromatographie und Massenspektrometrie (GC/MS) analysiert. Die Identifizierung der chromatographischen Peaks erfolgte durch Abgleich mit der NIST-Datenbank sowie dem Kovats-Retentionsindex.

Die HSSE-TDU-GC/MS-Analyse von Ast- und Blattwerk einer gesunden Pflanze brachte 79 natürlicherweise emittierte VOCs zu Tage; die SBSE-TDU-GC/MS-Analyse des Methanol-Blatt-Extraktes 115 VOCs, davon fanden sich 54 auch bei der HSSE-Analyse. Die größere, mit der SBSE erzielte Zahl, erklären sich die Forscher durch die zusätzliche physische Verletzung der Blattmatrix, die eine vermehrte Emission von VOCs verursache. Die am häufigsten mittels HSSE und SBSE gemessenen Verbindungen waren Sesquiterpene, Monoterpene, Diterpene und Terpenoide.

Anschließend wurden die Pflanzen geimpft bzw. scheingeimpft, und nach rund 130 Tagen erfolgte die HSSE respektive SBSE der VOCs. Hierbei fanden die Wissenschaftler mit beiden Methoden eine Verbindung, die in gesunden Pflanzen deutlich höher vorliegt: 3-Hexenylpentanoat. Insgesamt stellten Mitchel M. McCartney et al. fest, dass das VOC-Signal in seiner Gesamtheit bei den infizierten Pflanzen abnimmt, was die Wissenschaftler mit einer mutmaßlichen Abnahme der pflanzlichen Stoffwechselaktivität erklären. Darüber hinaus hätten sie bei den mit P. ramorum geimpften Pflanzen gehäuft die Verbindung 1-Octen-3-ol gefunden, welches seinen Ursprung vermutlich im Stoffwechsel des Erregers hat.

Die SPME des Ablaufwassers ergab bei den geimpften Pflanzen vier flüchtige Verbindungen, die nur im Boden vorkamen, der mit dem Erreger infiziert war. Hierbei handelte es sich um Rückstände ungesättigter Fettsäuren wie Hexadecensäure und Octadecensäure, die unmittelbar von den pathogenen Keimen stammen. Alles in allem, mutmaßen die Wissenschaftler, liefere die von ihnen durchgeführte Analytik einen guten Ansatz zur Entwicklung eines wirksamen Diagnosewerkzeugs, mit dem sich Phytophthora-Infektionen in Gärtnereien und Gewächshäusern frühzeitig erkennen lassen. Weitere Forschung ist angezeigt und notwendig.

Literatur:

[1] Mitchel M. McCartney et al., Effects of Phytophthora ramorum on volatile organic compound emissions of Rhododendron using gas chromatography-mass spectrometry, Analytical and Bioanalytical Chemistry 410 (2018) 1475-1487

* G. Deußing: Redaktionsbüro Guido Deußing, 41464 Neuss

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