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Lebensmittelkontrolle Pestizide anreichern und verschleppungsfrei bestimmen

Autor / Redakteur: Norbert Helle und Franziska Chmelka* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Die Bestimmung von Pestizidrückständen ist fester Bestandteil der Routine eines Auftragslabors, das sich auf die Lebensmittelkontrolle und -überwachung fokussiert hat. Effizienz ist bei der Bestimmung von Pestiziden unerlässlich. Die Strategie liegt in einer klugen Automatisierung.

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Im Obstanbau kommen häufig Herbizide zum Einsatz, die Phenylharnstoffe oder Triazine enthalten. Im Rahmen der Lebensmittlekontrolle bedarf es einer effizienten Analytik auf mögliche Rückstände.
Im Obstanbau kommen häufig Herbizide zum Einsatz, die Phenylharnstoffe oder Triazine enthalten. Im Rahmen der Lebensmittlekontrolle bedarf es einer effizienten Analytik auf mögliche Rückstände.
(Bild: Gerstel)

Zu den häufig vor allem im Obstanbau eingesetzten Unkrautvernichtungsmitteln (Herbiziden) gehören Präparate, die Phenylharnstoffe oder Triazine enthalten. Beide Wirkstoffklassen werden von der Pflanze über die Wurzeln aufgenommen und in die Chloroplasten transportiert, wo sie den Prozess der Photosynthese stören, was letztlich zu einem Absterben der Pflanze führt. Es liegt in der Natur der Unkrautvernichtung mittels chemischer Präparate, dass Rückstände, auch von Herbiziden bzw. Pestiziden, die nach ihrer Ausbringung vornehmlich in der obersten Bodenschicht verbleiben, die tieferliegenden Wurzeln der Kulturpflanze erreichen und von dieser aufgenommen oder noch tiefer in die Umwelt eingetragen werden. Bekannt ist, dass Pestizide vor allem im Grund- und Oberflächenwasser, unseren Trinkwasserspeichern, akkumulieren.

Um eine Gesundheitsgefährdung durch Pestizidrückstände zu minimieren, hat der Gesetzgeber die Belastung des Trinkwassers bezogen auf den einzelnen Wirkstoff bzw. relevante Metabolite mit entsprechend erlaubten Wirkstoff auf 0,1 µg/L begrenzt. Ein geeignetes Analysenverfahren sollte mit 0,01 µg/L eine Bestimmungsgrenze aufweisen, die noch um eine Zehnerpotenz niedriger ist. Diese zu erreichen wird konventionell oft nur möglich mittels einer Anreicherung der Analyten aus einem großen Probenvolumen (einige 100 mL) mit anschließender Injektion eines Aliquots des (reduzierten) Eluats in ein leistungsfähiges, sensitives HPLC/MS-System. Ungeachtet dessen, lassen sich nicht immer alle Substanzen bestimmen.

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Rückstände analysieren – Größere Probenvolumina oder Pestizide anreichern?

Aktuell geht man dazu über, größere Probenvolumina (bis 100 µL) direkt in das LC-System zu injizieren. Alternativ lassen sich die fraglichen Analyten mittels Online-Festphasenextraktion (SPE) auf fest-installierten Sammelkartuschen anreichern; ein weitverbreitetes, gängiges Prozedere. Beide Maßnahmen sind allerdings mit gewissen Nachteilen verbunden:

  • Die Injektion großer Probemengen (bis 100 µL) kann oftmals zu einer ungünstigen Peakverbreiterung führen. Zudem bedarf es meist eines hochsensitiven und gleichsam hochpreisigen Analysengeräts, um die geforderten Bestimmungsgrenzen zu erreichen.
  • Die Anreicherung der Analyten auf fest-installierten SPE-Kartuschen wiederum führt nicht selten zu störenden Substanzverschleppungen; ferner ist der damit verbundene vermeintliche Aufreinigungseffekt eher gering: Da die Kartusche üblicherweise von einer Seite beladen und in Gegenrichtung eluiert wird, können Störkomponenten leicht zusammen mit den Analyten auf die Trennsäule gelangen.

Die Idee lag nahe, den Aufreinigungsschritt der oben beschriebenen Online-SPE-Anreicherung effektiver zu gestalten. Zur Anreicherung einer 1-mL-Wasserprobe wurde ein spezielles Online-Modul (Gerstel-SPE-XOS) verwendet, das eben dies erlaubt.

Online-SPE-Anreicherung der Pestizide effektiver gestalten

Einige technische Details: Verglichen mit der klassischen SPE arbeitet das SPE-XOS-Modul mit kleineren Kartuschen; die Sorbensmasse beträgt nur 15 mg im Unterschied zur herkömmlichen SPE mit 50 bis 1000 mg. Die Extraktion lässt sich vollständig in den HPLC-Prozess integrieren, wobei die Elution der Analyten mit signifikant weniger Lösemittel erfolgt. Die SPE-XOS-Einheit wird unmittelbar zwischen Autosampler (Gerstel-Multi-Purpose-Sampler, MPS) und Chromatographie-System (Agilent 1260 HPLC/Triple Quad 6460) geschaltet. Die Aufgabe erfolgt online, das heißt, das Eluat – und damit 100 % der Analyten – wird direkt auf das HPLC-System überführt. Die Analyse erfordert, das zeigte die Praxis, somit nur eine geringe Probenmenge (1 – 5 mL), verläuft schnell und ermöglicht einen hohen Probendurchsatz.

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Ansteuern und in die Methode der Probenvorbereitung einbinden lässt sich die SPE-XOS-Einheit komfortabel per Mausklick im Menü der Steuersoftware (Gerstel-Maestro-Software); die Probenvorbereitung wiederum verläuft auf Wunsch zeitlich mit Chromatographie und Detektion der Analyten verschachteln (Prepahead-Funktion).

Der Einsatz eines SPE-XOS-Moduls barg einige interessante, der Sache dienliche Aspekte: Da sich die SPE-Kartuschen automatisiert vor jeder Probe auswechseln lassen, war mit Verschleppungen eher nicht zu rechnen. Der Reinigungseffekt wäre größer, da die Analyten das gesamte Sorbensbett der Kartusche in Beladungsrichtung zu durchwandern hätten und Störkomponenten somit effektiver zurückgehalten würden; zudem wären unterschiedliche beziehungsweise spezifische Clean-up-Schritte denkbar und möglich, da sich verschiedene Sorbensmaterialien einsetzen ließen, wahlweise auch sequenziell. Die Fokussierung der Analyten, die sich vollständig und verlustfrei von der Kartusche auf die Trennsäule überführen lassen, hätte schmale Peaks zur Folge. Soweit die Theorie.

Blick auf die technischen Details der Analyse

Die Praxis gestaltete sich wie folgt. Als einziger manueller Arbeitsschritt wurden die Wasserproben in Vials abgefüllt und auf dem MPS-Autosampler in Position gebracht. Die weiteren Schritte verliefen von der Software gesteuert vollständig automatisiert:

  • [LOAD] Einsetzen der SPE-XOS-Kartusche
  • [SPE PREP] Konditionierung mit 4 mL Methanol
  • [SPE PREP] Konditionierung mit 4 mL Wasser
  • [ADD] Laden von 1 mL Probe in die Probenschleife am MPS
  • [SPE PREP] Transfer der 1 mL Probe aus der Probenschleife auf die SPE-XOS-Kartusche mittels 1,5 mL Wasser
  • [SPE PREP] Ventilschaltung: Fluss der binären Pumpe wird über die SPE-XOS-Kartusche geschaltet
  • [INJECT] Startsignal für Agilent-Masshunter-Software

Die Parameter für die LC/MS-Analyse gestalten sich wie folgt: Eluent A: Ameisensäure 5 mmol/L; Eluent B: Acetonitril bei einer Flussgeschwindigkeit von 0,35 mL/min: 0 min: 5% B – 10 min: 50% B – 22 min: 100% B – 22,1 min: 5% B – Stoppzeit: 28 min. Säulenofentemperatur: 60 °C, Säule: C18-Material. Die Einstellungen am MSD (Quelle: Agilent Jetstream): ESI positiv, Gas Temp: 300 °C, Gas Flow: 9 L/min, Nebulizer: 45 psi, Sheath Gas Temp: 270 °C, Sheath Gas Flow: 12 L/min, Capillary: 5500 V, Nozzle: 300 V.

Schlussbetrachtung der Pestizidbestimmung

Jede Methode ist nur so gut, wie sie sich in der Praxis bewährt. Der Einsatz des SPE-XOS-Moduls, das eine Anreicherung der Analyten bei gleichzeitiger Aufreinigung des Extraktes sowie einen Wechsel der Kartuschen von Probe zu Probe zur Minimierung von Carry-over zulässt, erwies sich als treffend.

Bestimmt wurden in jeweils einem Milliliter Probe folgende Analyten: Metolachlor, Metazachlor, Diuron, Terbuthylazin, Metoxuron, Methabenzthiazuron, Chloridazon, Atrazin, Metribuzin, Chlortoluron, Isoproturon, Metamitron, Desethylatrazin und Desisopropylatrazin.

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Das Resultat der Methodenentwicklung kann sich sehen lassen: Im Vergleich zu einer Direktinjektion von 50 µL wurde eine Steigerung der Sensitivität um den Faktor 50 erreicht – ohne Peakverbreiterung. Lediglich die Retentionszeit verschob sich um eine halbe Minute nach hinten. Verschleppungen (carry-over effects) wurden nicht beobachtet. Neben der Steigerung der Sensitivität der Pestizidanalyse wurde bei der hier durchgeführten Probenvorbereitung ein deutlich saubererer Extrakt erhalten, was sich langfristig positiv auf das Analysensystem auswirkt. Nicht zuletzt wurde für alle im vorliegenden Fall untersuchten Substanzen eine Bestimmungsgrenze von unter 10 ng/L erreicht. Die Kalibrierung ergab eine durchweg gute Linearität. Die Analysendauer pro Probe beträgt etwa 14 Minuten.

* Dr. N. Helle, F. Chmelka: TeLA GmbH Bremerhaven, Fischkai 1, 27572 Bremerhaven

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