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Zuverlässige Covid-19-Diagnose Pipettenspitzen: Tests für sicheren Corona-Nachweis

| Autor / Redakteur: Dr. Brian Perry* / Christian Lüttmann

Viele Coronatests funktionieren über den Nachweis intakter viraler DNA. Diese muss nach dem Abstrich vor Zersetzung und Kontamination geschützt werden. Deshalb dürfen Proben nur mit Pipettenspitzen verarbeitet werden, die nachweislich frei von RNase und PCR-Inhibitoren sind. Eine Herausforderung für sich.

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Abb.1: Unter RNase-freien Bedingungen ist die Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) ein äußerst genaues Verfahren zur Erkennung von SARS-CoV-2.
Abb.1: Unter RNase-freien Bedingungen ist die Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) ein äußerst genaues Verfahren zur Erkennung von SARS-CoV-2.
(Bild: Mettler Toledo GmbH)

Zuverlässige Diagnosetests sind ein unverzichtbares Instrument im Kampf gegen Virusepidemien. Mit ihnen lassen sich Infektionserreger identifizieren und wirksame Therapeutika entwickeln. Diagnosetests ermöglichen es, die Ausbreitung einer Infektion innerhalb einer Bevölkerung zu überwachen und die Wirksamkeit von Gegenmaßnahmen und Eindämmungskonzepten zu messen. Zudem liefern genaue Diagnosen wichtige Informationen zu Krankheitsüberträgern – wie und auf welchen Wegen sie übertragen werden. Werden beispielsweise Familienmitglieder oder Kollegen infizierter Personen positiv mit Covid-19 diagnostiziert, zeigt dies, dass das Virus durch zwanglosen Kontakt in einer gemeinsamen Umgebung übertragen werden kann.

Die Gefahr von falsch negativen Befunden

Egal wie ausgereift ein Diagnosetest ist: Wenn die Probe nicht korrekt entnommen wurde oder im Nachhinein verunreinigt wurde, kann kein Test diese Fehler kompensieren. Bei dem neuartigen Coronavirus ist die Probennahme per Abstrich weniger trivial als man meinen könnte.

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SARS CoV-2 scheint sich hauptsächlich in den relativ unzugänglichen Bereichen der Lungen und des Nasopharynx aufzuhalten. Um eine testfähige Patientenprobe zu erhalten, muss ein verlängerter Tupfer (im Wesentlichen ein langes Wattestäbchen) geschickt durch das Nasenloch hindurch tief in den Nasenrachenraum eingeführt werden. Wenn der Tupfer nicht von einem erfahrenen Arzt gehandhabt wird, kann das zur Identifikation verwendete RT-PCR-Diagnoseverfahren durch eine geringe Viruskonzentration beeinträchtigt werden, wodurch ein falsch-negativer Befund riskiert wird.

Darüber hinaus führen Schwankungen der Viruslast im Krankheitsverlauf zu Schwankungen des Vorhandenseins der Viren in den Proben. Aufgrund einer Inkubationszeit von etwa zwei Wochen ist SARS CoV-2 möglicherweise auch bei korrekter Probennahme nicht nachweisbar – und das nur aufgrund eines schlechten Timings.

Selbst sorgfältig entnommene Patientenproben können aus diesem Grund zu falsch-negativen Befunden führen. Schließlich führt alles, was die Integrität der Virus-RNA beeinträchtigt dazu, dass der Diagnosetest das Virus nicht erkennen kann.

So funktionieren Tests auf RT-PCR-Basis

Das SARS CoV-2-Virus ist ähnlich aufgebaut wie andere Coronaviren, das HI-Virus, Ebola und die häufig vorkommenden Influenza-A- und B-Viren: Es besteht aus einem einzigen RNA-Strang (Ribonukleinsäure), der in einem Schutzproteinkomplex bzw. „Capsid“ enthalten ist. SARS CoV-2- und Influenza-Viren weisen nicht nur eine ähnliche genetische Zusammensetzung auf, sondern können auch ähnliche Symptome hervorrufen, wodurch es schwierig ist, eine Virusinfektion anhand externer Symptome von einer anderen zu unterscheiden. Deshalb sind virenspezifische Diagnosetests erforderlich. RT-PCR ist ein Molekulartest, der SARS CoV-2-spezifische Ribonukleinsäuresequenzen darstellen kann.

Die Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR) wandelt einsträngige RNA in einem zweistufigen Verfahren in doppelsträngige komplementäre DNA (cDNA) um. Der erste Schritt ist die Reverse Transkription (RT), bei der komplementäre Nukleotide des Virus-RNA-Moleküls als cDNA-Einzelstrang zusammengebaut werden. Im zweiten Schritt wird die PCR verwendet, um eine doppelsträngige cDNA-Version (ds cDNA) der ursprünglichen cDNA exponentiell zu vervielfältigen. Danach ist die DNA in ausreichender Menge vorhanden, um für Diagnose-, Sequenzierungs-, Klonungszwecke usw. verwendet zu werden.

Die doppelsträngige cDNA, in der die ursprüngliche RNA-Sequenz des Virus enthalten ist, wird zur Darstellung der ursprünglichen RNA verwendet. Sollte eine Quantifizierung infektiöser RNA-Viren erforderlich sein, kann die RT-PCR mit quantitativer PCR (qPCR) gekoppelt werden, um qRT-PCR zu erhalten. Dieses Verfahren misst die „Viruslast“ eines Patienten, die den Grad der Infektion, die Reaktion auf die Medikamententherapie usw. anzeigt.

Mit RNase fällt das Testurteil negativ aus

Damit ein Diagnosetest zuverlässig funktioniert, müssen seine molekularen und enzymatischen Wechselwirkungen unter sauberen, kontaminationsfreien Bedingungen erfolgen. Das bedeutet, dass Spitzen, Röhrchen, Platten usw., die an den Tests beteiligt sind, nur aus reinen, hochwertigen Materialien hergestellt werden dürfen und unter außergewöhnlich sauberen Bedingungen verpackt werden müssen. Hersteller müssen Kunststoffprodukte gewissenhaft testen, um auch nicht direkt nachweisbare Mengen potenzieller Kontaminanten zu überprüfen sowie sicherzustellen, dass diese unreaktiv sind.

Dies gilt insbesondere für Diagnosetests, die auf dem Vorhandensein von RNA basieren. RNA ist ein sehr empfindliches Molekül, das bereits durch kleinste Spuren von RNase leicht abgebaut wird. RNasen sind sehr haltbare und aggressive Enzyme, die in einer Laborumgebung erhebliche Schäden anrichten können, auch wenn sie nur in Spuren vorkommen. RNase, die in Produktions- oder Verpackungsumgebungen für Pipettenspitzen vorhanden ist oder durch menschlichen Kontakt während der Produktion eingebracht wird, kann daher die Testergebnisse gefährden. Da jeder erfolgreiche molekulare Diagnosetest auf SARS CoV-2 vom Vorhandensein intakter SARS CoV-2 RNA abhängt, ist es von entscheidender Bedeutung, dass solche Tests mit Pipettenspitzen durchgeführt werden, die nachweislich frei von detektierbarer RNase sind. Tabelle 1 zeigt RNase-Tests verschiedener Hersteller im Vergleich zu dem Bio-Clean-Ultra-Test von Rainin. Viele Hersteller von Pipettenspitzen geben lediglich an, dass ihre Spitzen „RNase-frei“ sind. In Ermangelung festgelegter Nachweisgrenzen (LODs) können keine Rückschlüsse im Hinblick auf die Testintegrität gezogen werden. Weitere Infos zu den Pipettenspitzen von Rainin finden Sie im LP-Infokasten.

* Dr. Brian Perry, Mettler Toledo GmbH, 35396 Gießen

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