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Pipettieren am Nanoliterlimit Präzises Automatisieren von Liquid-Handling-Applikationen

Autor / Redakteur: Ariane Jonetz-Mentzel* / Dr. Ilka Ottleben

Das Hochdurchsatz-Screening (HTS) im Mikroplattenformat steigert die Effizienz von Prozessen wie Wirkstoffscreening oder Assay-Entwicklung erheblich. Die dabei verwendeten hochdichten Plattenformate bis hin zur 1536er Mikroplatte und da­rüber hinaus bringen für die automatisierte Probenvorbereitung große technische Herausforderungen mit sich.

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Abb. 1: Spotten von 100 nl Flüssigkeit mit dem Cybio-Well-vario-1536/8-µl-Kopf mit Stahlspitzen auf eine MALDI-TOF-Target-Platte.
Abb. 1: Spotten von 100 nl Flüssigkeit mit dem Cybio-Well-vario-1536/8-µl-Kopf mit Stahlspitzen auf eine MALDI-TOF-Target-Platte.
(Bild: Analytik Jena)

Die Einführung der Mikroplatte als Trägerformat für Assays in Kombi­nation mit Liquid-Handling-Automatisierung und der Einsatz von entsprechenden Analysegeräten waren der Beginn des Hochdurchsatz-Screenings (High Throughput Screening, HTS) in den späten 1980er Jahren. Die konsequente Miniaturisierung und Parallelisierung vom 96er Plattenformat bis hin zur 1536er Mikroplatte und darüber hinaus sowie die damit einhergehende Adaptierung der Gerätetechnik stellen nachweislich die Schlüsselmechanismen in der Entwicklung des HTS dar.

Neben allen offensichtlichen Vorteilen der Automatisierung von Laborprozessen, wie Effizienzsteigerung und Erhöhung der Reproduzierbarkeit bringt die Automatisierung von hochdichten Mikroplattenformaten große technische Herausforderungen mit sich. Verringerte Toleranzen bei der Fertigung von Verbrauchsmaterialen werden immer wichtiger. Der Einfluss der physikalischen Eigenschaften der verwendeten Flüssigkeiten nimmt im Mikro- bis Nanoliterbereich deutlich zu. Ein stark verringerter Bauraum erfordert eine neue technische Umsetzung der nun 1536-kanaligen Kolbenhubpipette.

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Liquid-Handling-Automation – Präzision durch Variabilität

Dank 20-jähriger Erfahrung im Automatisieren von Liquid-Handling-Applikationen im Bereich des HTS und uHTS ist es Analytik Jena gelungen, die Ansprüche an die automatisierte Probenvorbereitung für unterschiedlichste Assays im hochdichten Mikroplattenformat mit bis zu 1536 Wells zu erfüllen. Die Verwendung sehr unterschiedlicher Spitzentypen erlaubt eine hohe Diversität der möglichen Anwendung mit dem Cybio-Well-vario-1536/8-µl-Kopf. Das Arbeiten mit Einwegspitzen aus Polypropylen oder mit in speziellen Magazinen fixierten Spitzen aus Keramik, Stahl und Glas gestaltet den Laboralltag des HTS sehr flexibel und garantiert eine hohe Assay-Integrität.

Zu den klassischen Anwendungen in diesem Plattenformat zählen u.a. zellbasierte Assays wie Antikörperscreening oder Enzym-Assays. Für die Liquid-Handling-Automatisierung bedeutet das vor allem die flexible Anpassung der Pipettierparameter, um ein schonendes Zell-Handling garantieren zu können. Auch das Pipettieren von kleinsten Compound-Mengen ohne Vorverdünnungsstufen ist eine zwingende Notwendigkeit, da die Toleranzgrenze der Zellkulturen hinsichtlich des DMSO-Eintrags oder der eines anderen Lösungsmittels bei ca. 1% liegt. Der Cybio-Well-vario-1536/8-µl-Kopf hat je nach Spitzentyp einen Arbeitsbereich von 0,1 bis 8 µl und ist somit bestens auf die Ansprüche des HTS vorbereitet. Die Verwendung der so genannten Air-Displacement-Technologie in der Cybio-Well-vario-Familie garantiert durchgängig eine hohe Präzision im Bereich von 100 nl bis 250 µl. Der Einsatz der Einwegspitzen aus Polypropylen oder der wiederverwendbaren Glasspitzen im Cybio-Well-vario-1536/8-µl-Kopf ermöglicht eine exzellente Pipettierperformance bei der Durchführung von zellbasierten Assays.

Unter Verwendung der flexiblen Steuersoftware Cybio Composer können die Protokolle optimiert und Hürden des klassischen HTS genommen werden, sodass bei der Abgabe von 1 µl Flüssigkeit Präzisionen kleiner als 2% [CV] erreicht werden können. Dank seiner variablen Bauweise kann der Cybio Well vario nicht nur im hochdichten Plattenformat arbeiten. Sein Wechselkopfsystem lässt auch die Bearbeitung von 96er und 384er Platten zu, sodass auch das traditionelle Befüllen und Reformatieren von Platten einfach und effizient durchgeführt werden kann.

Bei der automatisierten Probenvorbereitung im Bereich der qPCR ist zusätzlich ein flexibler Umgang mit speziellen 1536er Mikroplatten erforderlich. Die Verwendung des Roche Lightcycler 1536 als Analysegerät setzt die Verwendung einer Mikroplatte voraus, die vom standardisierten SBS-Mikroplattenformat geringfügig abweicht. Da Analytik Jena seit jeher bestrebt ist, mit ihrer Geräteentwicklung individuellen Kundenanforderungen bestmöglich zu entsprechen, gibt es auch hier eine passende Lösung.

Geringe Fertigungstoleranzen und die richtige Materialauswahl in der Spitzenproduktion spielen bei der Verwendung dieser im Hochdurchsatz eine große Rolle. Der Anspruch an die Spitzen ist hinsichtlich der Geradheit, der absoluten Längengleichheit sowie des geringen Durchmessers besonders hoch. Der Einfluss der Spitzen- und Plattengeometrie auf das Gelingen eines qPCR-Ansatzes ist in diesem Arbeitsformat umso größer. Durch die Verwendung nicht-standardisierter Plattenformate mit geringerem Rastermaß (2,24 mm statt 2,25 mm) und verringertem Welldurchmesser (1,4 mm statt 1,8 mm) ist die Anforderung an die Automatisierung einer HT-qPCR sehr hoch. Mit dem entsprechend angepassten Stahlspitzenmagazin von Analytik Jena mit einem Spitzendurchmesser von 0,5 mm und der Verwendung der richtigen Adapter zur Kompensation der Durchbiegung der Platte (> 100 µm) kann die Roche-Lightcycler-Platte 1536 problemlos für die HT-qPCR vorbefüllt werden.

Geschwindigkeit kombiniert mit Reproduzierbarkeit

Die Ansprüche der Probenvorbereitung im hochdichten Plattenformat an die Liquid-Handling-Automatisierung sind sehr verschieden. Durch die Entwicklung schneller Analysegeräte, wie dem Rapiflex von Bruker, ein Massenspektrometer für die Matrix unterstützte Laser-Desorptions/Ionisierungs-Massenspektrometrie (MALDI-MS), sollten entsprechende Probenvorbereitungen die Effizienz dieser Analysemethode unterstützen. Die Cybio Well vario 1536 Liquid Handling Workstation von Analytik Jena ist in der Lage, die spezifischen Probenplatten in einer zur Dauer der Analyse des Massenspektrometers äquivalenten Zeit vorzubereiten (< 10 min), sodass das Screening von einer Million Proben in weniger als fünf Tagen möglich wird.

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Das hier verwendete Prinzip der Spot-on-Spot-Pipettierung (Matrix-Assay-Matrix-Sandwich) bei der Probenvorbereitung verlangt dem Pipettierroboter eine sehr hohe Präzision und Positioniergenauigkeit ab. Durch den Aufbau des Cybio Well vario unter Verwendung eines fixierten Pipettierkopfes statt einer beweglichen Pipettierkopfeinheit und eines präzisen Plattenaushebers kann die erforderliche Positioniergenauigkeit beim wiederholten Spotten in der MALDI-TOF-Probenvorbereitung im 1536er Raster erreicht werden. Die Verwendung von Keramikspitzen mit einem Arbeitsvolumen von 0,1 nl bis1 µl resultiert in einer hohen Präzision bei der Tropfenabgabe auf die MALDI-Target-Platte (CV % kleiner als 2%).

Die Integrität des Assays wahren

Bei der Automatisierung der oben genannten Assays werden die Spitzen während eines Durchlaufs nicht ausgewechselt. Der Einfluss der Wascheffizienz steigt und wirkt sich signifikant auf die Qualität des Assays aus. Adhärente Flüssigkeiten lagern sich an der Spitzenoberfläche ab oder bilden einen Flüssigkeitsfilm in der Spitze. Durch die Geometrie der schmalen Spitzen, die vor allem im Hochdurchsatz zum Einsatz kommen, ist der Einfluss der Oberflächeneffekte sehr groß, und auch ein starkes Ausblasen der Spitze kann sie nicht vollständig von der Restflüssigkeit befreien. Deshalb kann es zu einer Verschleppung der Restflüssigkeit kommen. Um daraus resultierende Kreuzkontaminationen beim Reagenzien-Transfer ausschließen zu können, wurde von Analytik Jena eine spezielle und effizient arbeitende Waschstation entwickelt (s. Abb. 3 und 4). Die Waschstation besteht aus einem kontinuierlich durchspülten Reservoir für die entsprechende Waschlösung und einem Trog mit Abtupfflies aus Glas-Mikrofaser, der durch Anlegen eines Vakuums die Flüssigkeit aus den Spitzen beim Ausblasen komplett absaugt. Nach nur drei Waschzyklen mit einer geeigneten Waschlösung ist üblicherweise keinerlei Kreuzkontamination mehr nachweisbar.

Flexibilität gepaart mit Robustheit

Die Robustheit und präzise Arbeitsweise der Liquid-Handling-Systeme von Analytik Jena sorgen für eine zuverlässige Probenintegrität und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Durch das bewährte Wechselkopfsystem des Cybio Well vario und die hohe Diversität der Spitzentypen können verschiedene Applikationsfelder optimal adressiert werden. Durchdachte Technologien und Zubehör komplettieren das Produktportfolio bei der Verwendung von hochdichten Plattenformaten. Die hochgradige Parallelisierung der Cybio-Well-vario-Köpfe mit bis zu 1536 parallel arbeitenden Kolbensystemen führt zu einer einzigartigen Effizienz und Geschwindigkeit der Probenbearbeitung im Hochdurchsatz bei gleichzeitig exzellenter Pipettiergenauigkeit sowohl in der Wirkstoffsuche als auch im Life-Science-Bereich.

* A. Jonetz-Mentzel: Analytik Jena AG, 07745 Jena

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