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Schadstoffe in Gewässern

Prioritäre Schadstoffe in Gewässerproben mit GC/Tof-MS nachweisen

21.08.2007 | Redakteur: Marc Platthaus

Für 132 Schadstoffe sind gesetzliche Höchstgrenzen in Trink- und Oberflächenwasser festgelegt.
Für 132 Schadstoffe sind gesetzliche Höchstgrenzen in Trink- und Oberflächenwasser festgelegt.

Die EG-Schadstoffrichtlinie 76/464/EG enthält 132 Schadstoffe, für die gesetzliche Höchstgrenzen in Trink- und Oberflächenwasser festgelegt sind. Davon sind über 100 durch Gaschromatographie analysierbar [1]. Eine neue GC/Tof-MS Methode kombiniert die GC mit der Flugzeit-Massenspektrometrie und ermöglicht das gezielte Screening von 107 Verbindungen in Oberflächenwasser bis zur gesetzgeberisch festgelegten Konzentration von 0,1 Mikrogramm pro Liter.Peter Hancock*, Keith Worrall* und Sandra Rontree*

Für den menschlichen Verbrauch bestimmtes Wasser unterliegt einer in der EG-Trinkwasserrichtlinie (98/83/EG) formulierten spezifischen Gesetzgebung, in der die Meldeschwelle für einzelne Schadstoffe bei 0,1 Mikrogramm pro Liter beträgt [2].

Die im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen analysierten Gruppen von Verbindungen stehen für eine breite Spanne an Polaritäten und Typen. Zu ihnen gehören Benzidine, Chloraniline, Chlornitrobenzole, Chlornitrotoluole, Chlorphenole, Chlortoluidine, OCs, OPs, PAHs, PCBs, Phenylharnstoffe, Triazine und flüchtige Amine. Für viele dieser Verbindungen dürfte es eine eigene dedizierte analytische Methode geben, die eine spezifische Extraktion/Aufreinigung und Endanalyse verlangt. Die Zusammenfassung dieser Gruppen in einer einzigen Methode würde allerdings eine signifikante Steigerung des Probendurchsatzes und eine Verkürzung der Analysezeit bedeuten.

In der Vergangenheit wurde bereits eine Methode publiziert, die Single-Quadrupol-Massenspektrometrie mit SIR (Selected-Ion-Recording) zum Screening der für GC zugänglichen Verbindungen nutzt [3]. SIR erlaubt das gezielte Screening einer endlichen Zahl zu erfassender Verbindungen. Dabei geht jedoch ein erheblicher Anteil der chemischen Informationen verloren. Aus diesem Grund sind in so genannten Non-Target-Screening-Umgebungen Vollspektrumtechniken weiterhin erforderlich.

Um eine geeignete Screeningtechnik zu schaffen, sind eine Reihe von Anforderungen hinsichtlich der Extraktion, Detektion, Lokalisierung und Identifikation aller Verbindungen zu erfüllen. Hierzu gehören:

  • eine minimale, nicht selektive Probenaufbereitung für eine große Spanne von Verbindungsgruppen mit unterschiedlichen Polaritäten,
  • eine einfache, hochauflösende GC-Separation zur Minimierung von Matrixeffekten bei gleichzeitigem Erhalt der Auflösung kritischer Paare sowie
  • eine automatisierte Peakerkennung und -dekonvulierung aller in der Probe enthaltenen Verbindungen.

Die Tof-MS (Flugzeitmassenspektrometrie) mit exakter Massenbestimmung ist eine Vollspektrumtechnik, die sich sowohl für gezielte als auch für ungezielte Screening-Ansätze verwenden lässt.

Es wird hier eine Methode vorgestellt, die sich für das gezielte Screening von 107 der GC zugänglichen Verbindungen in Oberflächenwasser bis zu der gesetzgeberisch festgelegten Konzentration eignet. Weiterhin wird eine Methode für das ungezielte Screening anderer Substanzen in Oberflächenwasser eingeführt, die automatische Peakerkennung und -dekonvulierung sowie die Bibliothekssuche der erhaltenen Massenspektren nutzt.

GC/Tof-MS – Probenvorbereitung und Analyse

Für die Probenvorbereitung wird zuerst 200 ml gefiltertes Probenwasser mit 1 N HCl auf pH 4,0 eingestellt. Das Spiking der Probe erfolgte mit 500 ng internen Standards (d5-Nitrophenol, 2-Fluorbiphenyl, p-Terphenyl-d14). Eine Waters Oasis-HLB-SPE-Säule (60 mg, 3 cc) wurde mit 6 ml Dichlormethan, 6 ml Acetonitril und 6 ml Wasser konditioniert. Die Probenbeladung erfolgte mit etwa 6 ml/min. Die Säule wurde mit 1 ml Wasser gespült und unter Stickstoff 20 Minuten getrocknet. Die Elution der Substanzen erfolgte hiernach mit zweimal 2,5 ml Dichlormethan. Es folgte unter Stickstoff und bei Umgebungstemperatur eine Volumeneinstellung auf 0,5 ml zur Bestimmung der Wiederfindung wurden 500 ng Standard (d10-Anthracen) bei einer Aufkonzentrierung um den Faktor 400 während der Extraktion zugegeben.

Für die chromatographische Trennung kam ein Agilent 6890N GC mit CTC Combipal-Autosampler in Verbindung mit einer DB-17ms-Säule (J & W Scientific, 30 m x 0,25 mm ID und 0,25 mm Filmdicke) zum Einsatz. Die Flussrate betrug konstant 1,0 ml/min Helium, das Temperaturprogramm begann bei 40 ºC (eine Minute halten) bis 310 ºC bei einer Heizrate von 15 ºC/min (elf Minuten halten). Die Gesamtzeit für den Durchlauf betrug 30 Minuten. Als Injektionsmethode wurde eine gepulste Injektion ohne Flussteilung verwendet (1 Mikroliter mit Double-Taper-Liner).

Als massenspektrometrischer Detektor wurde ein Waters Micromass-GCT-PremierTof-MS im EI-Modus (Elektronenstoßionisation) verwendet. Die Ionenquelle wurde bei 200 ºC mit einer Elektronenenergie von 70 eV und einem Auffangstrom von 200 mA betrieben. Die Temperatur der Transferleitung wurde während des Durchlaufs bei 280 °C gehalten. Die Aufnahme der Spektren erfolgte zwischen 50 und 550 Da mit einer Gesamt-Scanzeit von 0,1 s. Die Auflösung des Instruments war größer als 7000 Fwhm (Halbwertsbreite). Für die Datenakquisition kam die Waters Masslynx-Software Version 4.0 zum Einsatz. Die Verarbeitung der Daten erfolgte mit den Applikationsmanagern Targetlynx bzw. Chromalynx.

Ergebnisse und Diskussion der GC/Tof-MS-Analyse

Die Chromatographie war bezüglich Empfindlichkeit, Geschwindigkeit und Separationsleistung optimiert. Abbildung 1 zeigt ein typisches rekonstruiertes Ionenstrom-Chromatogramm (RIC) für alle Schadstoffe. Die 0,5 Mikrogramm pro Liter gespikten Trinkwasserproben wurden mit dem Ziel analysiert, die Wiederfindung jedes Schadstoffes bei Verwendung eines einzigen SPE-Sorbens zu ermitteln. Die Dichlormethan-Elution lieferte eine gute Leistung mit 72 Prozent wiedergefundenen Schadstoffen innerhalb des Bereichs von 70 bis 120 Prozent. Zu den mit einer Quote von weniger als 50 Prozent gefundenen Substanzen gehörten Verbindungen wie Disulfoton, das in wässriger Lösung rasch abgebaut wird, sowie Bentazon und die Benzidine, die sich besser für eine LC-Bestimmung eignen oder vor einer Analyse auf GC-Basis eine vorherige Derivatisierung erfordern. Die Wiederfindungsraten von Wasserstoffbrücken-Donoren ließen sich durch Hinzufügen von fünf Prozent Methanol in die Extraktionslösung verbessern, was im vorliegenden Fall jedoch nicht versucht wurde. Insgesamt ist die Verteilung der Wiederfindungsraten angesichts einer so großen Spanne an Polaritäten, Siedepunkten und Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten bei Verwendung eines einzigen SPE-Sorbens sehr gut. Die Nachweisgrenzen (LOD) wurden für die Bestätigung (zwei Feinmasse-Chromatogramme pro Verbindung) und das Screening (ein Feinmasse-Chromatogramm pro Verbindung) ermittelt. Alle LODs basieren auf einem Signal-Rausch-Verhältnis Peak-zu-Peak von 3:1. Die ermittelten LODs sind für eine derartig breite Spannweite von Verbindungen und eine einzige generische Extraktionsmethode ebenfalls sehr gut.

Die Chlorphenole (0,1 Mikrogramm pro Liter) wurden als Beispielverbindungen für die vorliegende Bestimmung ausgewählt. Sie demonstrieren die von Chromatogrammen mit exakter Massenbestimmung gebotene höhere Selektivität. Das in Abbildung 2 gezeigte Nominalmassen-Chromatogramm (1 Da, m/z 128) weist sieben ausgeprägte Peaks auf, die bei der Verwendung automatischer Integration zu Interferenzen führen könnten. Im exakten Masse-Chromatogramm (20 mDa, m/z 128,003) zeigen die drei Chlorphenole geringe bis gar keine Interferenzen, was die Selektivität der Methode verbessert. Diese Selektivitätssteigerung führt zu einem besseren Signal-Rausch-Verhältnis. Die durchschnittliche Differenz zwischen Nominalmassen-LOD und exaktem Masse-LOD lag für alle Rückstände innerhalb der Methode beim Faktor sechs. Bei Nominalmassendaten wären drei Ionen für die Bestätigung notwendig im Gegensatz zu zwei Ionen bei Daten aus exakter Massenbestimmung, und dies trägt zur weiteren Verbesserung der LODs für die Bestätigung bei. Bei selektiver Massendetektion (SIR) führt eine Erhöhung der Ionen-Zahl wie im Falle der Bestätigung zur Verminderung der Gesamtempfindlichkeit (Signal-Rausch-Verhältnis).

Mit Tof-Detektion führt eine Erhöhung der Zahl überwachter Massen nicht zur Abnahme der Empfindlichkeit. Der Wechsel vom Screening zur Bestätigung wirkt sich bei Tof nicht auf die LOD aus, sodass sich ohne Auswirkungen die Zahl der Bestätigungsionen steigern lässt. Es wurden Lösungsmittelstandards im Konzentrationsbereich von 1 bis 500 Picogramm pro Mikroliter vorbereitet (äquivalent zu 0,005 bis 2,5 Mikrogramm pro Liter). Als interner Standard wurde 2-Fluorbiphenyl für die Korrektur möglicher volumetrischer Fehler verwendet. Die Standards wurden im Rahmen einer typischen Batch-Analyse vor und nach den Trink- und Oberflächenwasserextrakten injiziert. Die Verarbeitung der resultierenden Daten erfolgte mit dem Waters Targetlynx-Application-Manager. Abbildung 3 zeigt den Targetlynx-Browser für 2-Chlor-4-toluidin bei einer gespikten Konzentration von 0,1 Mikrogramm pro Liter in Oberflächenwasser. Zur Bestätigung werden zwei extrahierte Feinmassen gezeigt.

Mit dieser Methode konnten das Vorhandensein von 99 Rückständen in Oberflächenwasser bis zu einer Konzentration von 0,1 Mikrogramm pro Liter bestätigt werden. Ein Screening war für 101 Substanzen bis zu der gleichen Konzentration möglich. Diese Zahlen sind nicht absolut zu verstehen, denn es ließen sich ohne Auswirkung auf die Empfindlichkeit weitere Rückstände hinzufügen. Die Ergebnisse zeigten, dass das GCT Premier in einer Umgebung für zielgerichtetes Schadstoff-Screening verwendbar ist.

Non-Target-Screening

In einer Umgebung für Non-Target-Screening kann die Lokalisierung Hunderter von Peaks notwendig sein, was bei manueller Vorgehensweise äußerst zeitaufwändig wäre. In diesem Fall ist eine automatische Verarbeitung unter Verwendung einer Dekonvulierungs-Software wie dem Waters Chromalynx-Application-Manager sinnvoll. Chromalynx stellt automatisch die RICs der acht stärksten Ionen an einem beliebigen Punkt des Chromatogramms dar. Wird ein Peak gefunden, der die vom Anwender definierten Parameter erfüllt, zeigt die Software das dekonvulierte Massenspektrum dieses Peaks an. Das Spektrum kann dann an eine automatische Routine für die Bibliothekssuche weitergeleitet werden, die eine Bestätigung durch die exakte Massenbestimmung leisten kann. Die Chromalynx-Verarbeitung des 0,5 Mikrogramm pro Liter gespikten Oberflächenwasser-Extraktes erbrachte beinahe 800 Komponenten im gesamten Chromatogramm. Im Extrakt wurden 180 Schadstoffe aufdotiert, von denen 100 Bestandteil der gezielten Methode sind.

Zu den nicht gezielt gesuchten Verbindungen, die mit Chromalynx gefunden wurden, gehörten 4-Bromdiphenylether, 2-Chlornaphthalen, Phenol, Dibenzofuran und Decachlorbiphenyl. In reinem Oberflächenwasser wurden mit Chromalynx einige nicht gezielt gesuchte, interessierende Schadstoffe gefunden und identifiziert, darunter beispielsweise 4-Methylbenzol-sulfonamid, (s. Abb. 4). Weitere gefundene Verbindungen waren Naphthalin und 1-Methylnaphthalin. Chromalynx nimmt basierend auf der exakten Massenbestimmung automatisch eine Bestätigung der Suchergebnisse in der Bibliothek vor. Die aus dem Treffer in der Bibliothek resultierende Formel wird auf ihre elementare Zusammensetzung untersucht und die stärksten Ionen werden anhand der exakten Masse bestimmt bzw. zurückgewiesen.

Fazit

Es wurde eine Methode zur gezielten Bestätigung von mehr als 100 prioritären Schadstoffen unter Verwendung von Oasis SPE-Extraktionskartuschen und des GCT Premier mit Targetlynx-Application-Manager vorgestellt.

Die Mehrheit der Schadstoffe konnte bis zu Konzentrationen unter 0,1 Mikrogramm pro Liter in Oberflächenwasser bestätigt werden, wobei eine einzige Injektionstechnik und Chromatogramme mit exakter Massenbestimmung verwendet wurden. Solche Chromatogramme mit exakter Massenbestimmung verbessern die verfügbare Selektivität und ermöglichen das Erreichen niedrigerer LODs. Diese Methode lässt sich aufgrund des durch Tof-Instrumente gebotenen Vollspektrum-Ansatzes ohne Empfindlichkeitsverluste auf eine größere Zahl von Rückständen ausweiten.

Die Einzelinjektion kann auch für das Screening nicht gezielt gesuchter Rückstände im selben Extrakt mittels Chromalynx-Application-Manager genutzt werden. Die Software ermöglicht die automatische Peakerkennung und -dekonvulierung sowie die Bibliothekssuche der Spektren und die Bestätigung basierend auf der exakten Masse.

Literatur

[1] http://europa.eu.int/comm/environment/water/ water-dangersub/76_464.htm#transition

[2] http://europa.eu.int/comm/environment/water/ water-drink/index_en.html

[3] Lacorte, S., Guiffard, I., Fraisse, D. and Barceló D., Anal. Chem. 72 (2000) 1430.

*P. Hancock, K. Worrall und S. Rontree, Waters Corporation, Manchester/Großbritannien

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