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Automatisierter Proteinverdau für die MS-basierte Proteomik Probenvorbereitung im „Verdauungsapparat“

Autor / Redakteur: Dr. Martin Technau, Ulf Sengutta* / Christian Lüttmann

Proteine sind vielseitige Biomoleküle, die zentrale Prozesse im Körper steuern. Ihre Analytik ist ein komplexes Unterfangen, müssen doch diverse Aufreinigungs- und Probenvorbereitunsgschritte erfolgen, etwa das „Verdauen“ in kleinere Fragmente. Idealerweise erfolgen alle Schritte automatisiert in einem einzigen Gerät.

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Abb.1: Digest Pro – Vollautomat für die Proteomik. Proteinverdau, Probenaufreinigung und ­MALDI-Spotting auf einer Plattform.
Abb.1: Digest Pro – Vollautomat für die Proteomik. Proteinverdau, Probenaufreinigung und ­MALDI-Spotting auf einer Plattform.
(Bild: CEM)

Proteine bzw. Peptide sind sozusagen die Arbeitstiere in lebenden Organismen. Ob als Hormone, Neurotransmitter oder Enzyme – zahlreiche lebenswichtige Funktionen sind auf diese Molekülklassen zurückzuführen. Daher gibt es ein großes Interesse daran, Peptide und Peptido-Mimetika zu analysieren und näher zu erforschen, etwa für den Einsatz als medizinische Wirkstoffe oder zur Diagnostik von Patientenproben. Die Sequenz- und Strukturanalyse von Proteinen ist dementsprechend ein wichtiges Aufgabenfeld.

Unverzichtbar ist hier die Analyse der Gesamtheit aller in einer Zelle oder einem Lebewesen vorliegenden Proteine, die so genannte Proteomik. Sie lässt sich heutzutage mithilfe der Massenspektrometrie bewerkstelligen und hilft dabei, biochemische Signal­transduktionswege aufzuklären, molekulare Ursachen von Krankheiten zu verstehen, Wirkungsmechanismen bereits bekannter Arzneistoffe zu erkennen sowie neue Targets für Diagnostika und Medikamente zu entdecken. Für die massenspektrometrische Analyse müssen die zu untersuchenden, hochkomplexen Proteingemische allerdings zunächst aufgetrennt werden, z.B. per Gelelektrophorese (s. Ergänzendes zum Thema). Dabei müssen die Proteine vor der Analyse am Massenspektrometer enzymatisch in kürzere und leichter zu handhabende Peptide gespalten werden. Wegen der Sequenzspezifität der verwendeten Proteasen ergibt sich ein charakteristisches Peptidgemisch. Die daraus erhaltenen Massenspektren werden computergestützt mit Proteindatenbanken wie Swiss Prot oder www.expasy.ch abgeglichen. Dann ermittelt die Software, wie gut die experimentell erhaltenen Peptidmassen mit den theoretisch ermittelten übereinstimmen. Aus diesem Abgleich lassen sich Proteine mit hoher Wahrscheinlichkeit identifizieren.

Zum kompletten Ablauf eines Proteinverdaus gehören allerdings noch viele weitere Schritte: Die Reduktion intramolekularer Disulfidbrücken, die anschließende Alkylierung der entstandenen Cysteine, Wasch- und Entfärbungsschritte bei Gel-basierten Methoden und die abschließende Extraktion der Proben aus dem Gel. Der gesamte Verdauprozess ist also sehr arbeitsaufwändig. Will man solche Experimente manuell durchführen, limitiert das zwangsläufig den Probendurchsatz und birgt zudem das Risiko von ­Kontaminationen. Die Methode muss daher automatisiert werden, damit sich Proteine auch in hohem Durchsatz sicher identifizieren lassen.

Vollautomat für Protein­verdau-Protokolle

Mit dem Digest Pro Verdauautomaten bietet die Firma CEM eine Komplettlösung zur Automatisierung von Proteinverdau-Methoden sowie nachfolgenden Techniken zur Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie (Abb. 1). Das auf der Basis von der Firma Intavis vertriebene Gerät ist für den Einsatz in der MS-basierten Proteom-Forschung optimiert und lässt sich über unterschiedliche Module an individuelle Labor-Anforderungen anpassen (Abb. 2).

Abb.2: Modularer Aufbau der Digest Pro-Arbeitsfläche. Freie Anpassung der Geräte-Konfiguration an individuelle Anforderungen.
Abb.2: Modularer Aufbau der Digest Pro-Arbeitsfläche. Freie Anpassung der Geräte-Konfiguration an individuelle Anforderungen.
(Bild: CEM)

Beliebige Verdauprotokolle, egal ob In-Gel oder in Lösung, lassen sich unter präzise kontrollierten und reproduzierbaren Bedingungen automatisieren. Für den Verdau in Lösung lassen sich je nach Anforderung unterschiedliche Formate verwenden, z.B. 96-Well-Platten, Autosampler-Vials oder verschiedene Mikro-Reaktionsgefäße. Bis zu 96 Proben können parallel verarbeitet werden. Für den In-Gel-Verdau wird ein speziell entwickeltes ven­tilloses Verfahren eingesetzt. Der Verdau findet in 96-Well-PCR-Platten statt, was die Bearbeitung von bis zu 96 Gelstücken in einem Lauf ermöglicht und den einfachen Transfer zu anderen Geräten erlaubt.

Beim Proteinverdau dürfen keine Kontaminationen mit Staub oder Hautschuppen des Benutzers auftreten. Am Digest Pro werden die Reaktionsgefäße daher durch eine Dichtungsmembran abgedeckt, die nur ein kleines Loch für die Dosierkanüle frei lässt. Durch feine Löcher im Boden der Gefäße lassen sich Reagenzien ausblasen. Dazu wird die spezielle Kanüle so tief in die Membran gefahren, dass sie in dem Loch abdichtet. Über einen separaten Kanal können nun die Flüssigkeiten durch die Löcher im Boden ausgeblasen werden (Abb. 3). Neue Reagenzien werden ohne Druck zudosiert und durch Oberflächenspannung im Reaktionsgefäß gehalten. Die Inkubation mit verschiedenen Puffern und Reagenzien für definierte Zeiträume lässt sich so leicht und zuverlässig durchführen. Durch die Membran wird die Verdunstung von Reagenzien verhindert. Da das Gelstück nie mit der Kanüle in Berührung kommt, ist ein Verlust ausgeschlossen und das Risiko der Kontamination gegenüber offenen Systemen drastisch reduziert.

Abb.3: Für den In-Gel-Verdau verwendet der Digest Pro eine einzigartige 2-Kanal-Nadel. Zum Ausblasen des Reaktionsgefäßes über den Luftkanal dichtet die Nadel in der Dichtungsmembran ab. Die Flüssigkeitszugabe neuer Reagenzien erfolgt über die innere Nadel. Durch dieses Prinzip ist ein robuster und präziser Flüssigkeitsaustausch gewährleistet, ohne die Risiken von Kontaminationen oder eines Verlusts von Gelstücken. (1: Ausblasen über Luftkanal, 2: Dichtungsmembran, 3: Gelstücke, 4: Flüssigkeitszugabe)
Abb.3: Für den In-Gel-Verdau verwendet der Digest Pro eine einzigartige 2-Kanal-Nadel. Zum Ausblasen des Reaktionsgefäßes über den Luftkanal dichtet die Nadel in der Dichtungsmembran ab. Die Flüssigkeitszugabe neuer Reagenzien erfolgt über die innere Nadel. Durch dieses Prinzip ist ein robuster und präziser Flüssigkeitsaustausch gewährleistet, ohne die Risiken von Kontaminationen oder eines Verlusts von Gelstücken. (1: Ausblasen über Luftkanal, 2: Dichtungsmembran, 3: Gelstücke, 4: Flüssigkeitszugabe)
(Bild: CEM)

Die zum Verdau benutzte Reaktionsplatte ist in einem verschiebbaren Heizblock montiert. Nach der Zugabe von Enzym wird der Block aus der Ablaufposition auf die Elutionsposition geschoben, um die Peptidlösungen in einer sauberen PCR-Platte auffangen zu können. Auch hier bewährt sich das ventillose Reaktionsgefäß: Es gibt keine Spalten, Ventile oder Toträume und der Überstand lässt sich vollständig in die Auffangplatte übertragen. Das Gelstück wird in jedem Fall zurückgehalten. Der Digest Pro erlaubt eine freie Temperaturregelung mit Heiztemperaturen bis zu 65 °C sowie im Anschluss an den Verdau eine Kühlung der Peptidgemische auf 8 °C.

Optionale Proben- Aufreinigung

Über den Proteinverdau hinaus erlaubt der Digest Pro die Automatisierung weiterer Probenvorbereitungsschritte. Für die einfache und effektive Probenentsalzung und Aufkonzentrierung kann am Gerät die Verwendung von Zip Tips von Millipore oder kompatiblen Re­versed Phase Tips automatisiert werden. Die C-18-Pipettenspitzen werden dabei auf der Arbeitsfläche vorgelegt, von wo aus sie durch die Pipettiernadel aufgenommen und für einen erneuten Zugang wieder abgelegt werden können. Die an das C-18-Substrat gebundenen Peptide erlauben Waschschritte direkt in der Pipettenspitze und eine Elution in einem reduzierten Volumen in beliebige frische Reaktionsgefäße (Platten oder Vials). Das automatisierte Spitzen-Handling führt zu deutlich besseren Resultaten und einer erhöhten Reproduzierbarkeit der Zip-Tip-Methode im Vergleich zur manuellen Verwendung. Das liegt vor allem daran, dass Flüssigkeiten direkt durch das C-18-Material in die Pipettiernadel aufgenommen werden können, wodurch das Totvolumen verringert und präzise Flussraten erreicht werden. Die direkte Abgabe von Flüssigkeiten durch die Nadel über die Innenseite des C-18-Materials erlaubt es darüber hinaus, Pipettenspitzen mit erhöhtem Gegendruck zu verwenden (z.B. selbst gefertigte Stage-Tips).

Optional können die Proben am Digest Pro auch direkt auf MALDI-Target-Platten aufgetragen werden. Hierfür lassen sich unterschiedliche MALDI-Spotting-Methoden anpassen (z.B. direktes Spotten mit Zip Tips, Dried-Droplet-Methoden, Sandwich-Methoden, Anchor-Chip-Targets). Dabei können beliebige MALDI-Target-Formate am Gerät verwendet werden.

Probenvorbereitung zur Proteom-Analytik

Um Proteine per MS zu identifizieren, muss man sie durch enzymatischen oder chemischen Verdau in definierte Peptidfragmente zerlegen. Manuell durchgeführte Experimente limitieren aber den Probendurchsatz und bergen das Risiko von Kontaminationen. Deshalb ist es sinnvoll, solche komplexen Protokolle zu automatisieren, etwa mithilfe des kompakten Digest Pro Vollautomaten. Damit lässt sich nicht nur der Probendurchsatz erhöhen, sondern auch ein kontaminationsfreies Arbeiten gewährleisten – dank der geschlossenen Bauweise und eines speziell entwickelten Verfahrens zum Reagenzien-Austausch.

Im Digest Pro können sowohl für In-Gel- als auch In-Lösung-Protokolle bis zu 96 Proben simultan gewaschen, reduziert, alkyliert und verdaut werden. Im Anschluss an den Verdau können die Peptide optional mit Reverse-Phase-Pipettenspitzen vollautomatisch entsalzen und aufkonzentriert werden. Weitere Optionen sind das Überführen in Autosampler-Vials oder das Spotten auf MALDI-Targets. Durch die Verwendung laboreigener Puffer und Lösungen entstehen keine zusätzlichen laufenden Kosten. Der Digest Pro wird durch eine intuitiv bedienbare Software gesteuert, mit der sich eigene Protokolle individuell anpassen lassen. Vorinstallierte Standardprotokolle ermöglichen einen komfortablen Einstieg in die Automatisierung.

* Dr. Martin Technau, Ulf Sengutta, CEM GmbH, 47475 Kamp-Lintfort

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