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Feldflussfraktionierung

Proteinablagerungen mit Feldflussfraktionierung analysieren

| Autor/ Redakteur: Thomas Jocks* / Marc Platthaus

Proteinablagerungen im Gehirn weisen ein enormes Größenspektrum auf. Die Größe reicht von kleinen Oligomeren bis hin zu riesigen Amyloid-Fibrillen. Bei der Analyse stoßen die Größenauschluss-Chromatographie oder die Polyacrylamid-Gelelektrophorese an ihre Grenzen. Die Feld-Fluss-Fraktionierung mit anschließender Lichtstreudetektion kann hier Abhilfe schaffen.

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1 Das Feldflussfraktionierungs-System Eclipse ermöglicht die Trennung von Proteinen über einen weiten Größenbereich.
1 Das Feldflussfraktionierungs-System Eclipse ermöglicht die Trennung von Proteinen über einen weiten Größenbereich.
( Bild: Wyatt Europe )

Neurodegenerative Erkrankungen wie beispielsweise die Parkinsonsche Krankheit, Morbus Alzheimer und die übertragbaren „Spongiformen Enzephalopathien“ (TSEs oder Prionen-Erkrankungen) sind schon seit einiger Zeit im Fokus der Wissenschaft. Ein biochemischer Vorgang, der allen diesen Krankheiten gemeinsam ist, erlangte dabei besondere Aufmerksamkeit: Die Bildung abnormaler Proteinablagerungen im Gehirngewebe betroffener Patienten.

Diese Eiweißaggregate besitzen eine Größe, die von kleinen Oligomeren bis hin zu riesigen Amyloid-Fibrillen reicht. Traditionelle Separationstechniken wie etwa Größen-Ausschluss-Chromatographie (SEC, Size Exclusion Chromatography), Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE, Polyacrylamide Gel Electrophoresis) und Ultrazentrifugation stoßen angesichts solcher Aufgaben an die Grenzen ihrer Leistungsfähigkeit. Sowohl in der SEC als auch bei einer PAGE-Trennung kommt es häufig zur Adsorption der Aggregate an die stationäre Phase oder die Proteine sind während des Laufes erheblichen Scherkräften ausgesetzt.

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Das Problem bei der Ultrazentrifugation besteht in ihrem eingeschränkten Auflösungsvermögen. Durch den Einsatz des Eclipse-Trennsystems, das auf der Grundlage der Feld-Fluss-Fraktionierung (FFF) arbeitet, können diese Probleme nun erfolgreich überwunden werden.

Vermessung von Prion-Proteinen durch Feldflussfraktionierung

Im vorliegenden Fall wurden Aggregate aus Prion-Proteinen zunächst mit dem Eclipse-Instrument aufgetrennt. In der da-rauf folgenden on-line-Analyse kamen das 18-Winkel-Lichtstreuphotometer Dawn EOS mit Mals-Detektor (Multi-Angle Light-Scattering Detector, Mehrwinkel-Lichtstreudetektor), ein Optilab rex und das Wyatt-Qels-Instrument (Quasi-Elastic Light-Scattering, Quasi-elastische Lichtstreuung) zum Einsatz. Die mittlere Molmasse Mw, die Trägheitsradien rg sowie die hydrodynamischen Radien rh wurden gemessen. Mithilfe dieser Daten ließen sich anschließend Erkenntnisse über die räumliche Gestalt der Partikel gewinnen. Hierzu wurde aus den Werten für rg und rh der Quotient gebildet, und daraus der p-Wert als Verhältnis der Radien (rg/rh) ermittelt.

Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse aus den statischen (Mals) und dynamischen (Qels) Lichtstreuungsmessungen nach dem Trennvorgang. Bei den Molmassen zeigte sich eine große Variationsbreite unter den separierten Aggregaten, und zwar zwischen knapp 105 und mehr als 107 Dalton. Die Trägheitsradien bewegten sich zwischen zehn und etwa 300 Nanometer, während die hydrodynamischen Radien Werte von fünf bis über 50 Nanometer besaßen. Aus Abbildung 3 wird ersichtlich, dass die p-Werte (rg/rh) der früh eluierenden Fraktion, also der kleinen Aggregate, auf eine sphärische, kompakte Partikelform hinweisen. Die späten Eluate hingegen besitzen eine stark in die Länge gezogene, stabförmige Gestalt.

Fazit

Durch die Kombination von FFF, Mals und Qels können Partikel – selbst über ein enormes Größenspektrum hinweg – hinsichtlich ihrer Molmasse, ihrer Radien und ihrer räumlichen Gestalt aufgetrennt und sehr exakt charakterisiert werden. Diese hoch entwickelten Analysetechniken stellen damit ein gutes Werkzeug dar, um Protein-Aggregate zu studieren. Gerade da sie im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen immer mehr an Bedeutung gewinnen, kommt ihrer Analytik eine immer größere Bedeutung zu.

*Dr. T. Jocks, Wyatt Technology Europe, 56307 Dernbach

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Über den Autor

Marc Platthaus

Marc Platthaus

Chefredakteur, LABORPRAXIS - Mehr Effizienz für Labor & Analytik