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Analyten „Just in time“ in eine analysierbare Form überführen Punktlandung Derivatisierung

Autor / Redakteur: Guido Deußing* / Dr. Ilka Ottleben

Die GC/MS ist eine effiziente Methode zur Bestimmung von Zwischenprodukten biochemischer Stoffwechselvorgänge. Um polare Metaboliten GC-gängig zu machen, bedarf es i.d.R. einer zweistufigen Derivatisierung. Konventionell durchgeführt, ist diese arbeits- und zeitintensiv, und nicht einmal die Gleichstellung aller Proben ist gewährleistet. Automatisierung hingegen schafft beides: Effizienz und Egalität.

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Abb.1: Derivatisierungen im Labor benötigen zahlreiche Synthese- und Analyseschritte.
Abb.1: Derivatisierungen im Labor benötigen zahlreiche Synthese- und Analyseschritte.
(Bild: ©makyzz - stock.adobe.com)

Organismen erzeugen im Verlauf des ihnen eigenen biochemischen Stoffwechsels (Metabolismus) Verbindungen (Metaboliten), die u.a. auch gewisse Funktionen im Körper erfüllen. Metabolite dienen etwa als Botenstoffe, die als Symptom für Änderungen der normalen Körperfunktion auftreten, und zwar meist auf eine für uns unbewusste Art und Weise. Ausnahmen bestätigen die Regel: Die aus Schottland stammende ehemalige Krankenschwester Joy Milne beispielsweise ist in der Lage, eine Parkinsonerkrankung am Schweißgeruch eines Patienten zu erkennen, lange bevor eine ärztliche Anamnese den gesicherten Befund liefert [1].

Geübte Hunde sind in der Lage, Lungen- und Darmkrebserkrankungen, die mit Veränderungen des Stoffwechsels einhergehen, zu erschnüffeln. Nicht wenige Verschüttete verdanken ihr Leben dem feinen Gespür von Kaniden und viele Leichen wären unentdeckt geblieben, hätten nicht speziell trainierte Leichenspürhunde die leblosen Körper, selbst vom Boot aus auf dem Grund eines tiefen Sees gewittert. Am Flughafen von Helsinki kommen neuerdings Hunde zum Einsatz, die mit SARS-CoV-2 infizierte Personen mit der Nase erkennen sollen [2].

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Einblick in den Stoffwechsel

Geraten Pflanzen unter Stress, wenn sie von Schadinsekten befallen werden oder z.B. ungünstige Umwelt- und Klimabedingungen erfahren, ist das nicht auf Anhieb augenfällig, wohl aber auf molekularer Ebene feststellbar: Auch in der Botanik lassen sich physiologische Veränderungen von Pflanzen an der Art und Zusammensetzung der emittierten Stoffwechselprodukte messen. Das bietet Nutzen, denn bleibt ein krankhafter Zustand lange unerkannt, kann das bei Feldfrüchten, Obst, Gemüse oder Tee zu Qualitätseinbußen oder Ernteausfällen führen. Hält man hingegen die emittierten Metaboliten im Blick, lassen sich negative Einflüsse u.U. frühzeitig erkennen [3].

Die Überwachung biochemischer Stoffwechselaktivitäten sowie der daraus resultierenden körpereigenen (endogenen) Zwischenprodukte kann sich folglich als zielführend erweisen, frühzeitig den Einfluss und die Folgen innerer (intrinsischer) und äußerer (extrinsischer) Faktoren zu identifizieren.

Aufgabe der Metabolomics

Eben mit solchen Aufgaben beschäftigt sich die Metabolomics-Forschung. Ihr Untersuchungsgegenstand ist das Metabolom, die Gesamtheit aller charakteristischen Stoffwechselprodukte einer Zelle bzw. eines Gewebes. Die Bestimmung ausgewählter Metaboliten respektive die Untersuchung bereits geringster Veränderung in einem charakteristischen Profil von Metaboliten kann also Aufschluss geben über physische Prozesse und Zustände, lange bevor sie augenfällig werden.

Somit leistet die Metabolomics einen wichtigen Beitrag in der Entwicklung, Etablierung und Überwachung von Therapien im Bereich der medizinischen und Pharmaforschung wie auch bei der Produktion von Agrarerzeugnissen sowie von Tierfutter- und Nahrungsmitteln, etwa insofern Hersteller daran interessiert sind zu erfahren, ob und wenn ja, welche potenziell unerwünschten Metaboliten nach Verzehr ihrer Produkte im Organismus entstehen. Um einen dezidierten Blick in den biochemischen Stoffwechsel zu werfen, braucht es jedoch geeignete Instrumente und Methoden. Welches System oder welche Analysestrategie in Frage kommt, hängt nicht zuletzt von den zu untersuchenden Prozessen und Parametern ab.

Das Spektrum an Verbindungen, auf die Metabolomics-Studien fokussieren, ist weitgefasst: Für die Bestimmung von Verbindungen mit Molekülmassen (MW) größer 600 Dalton (Da) bedient man sich der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bzw. UHPLC mit Massenspektrometrie (MS). Die GC/MS kommt in Frage, erläutern David Beale und Avinash Karpe, bei Metaboliten mit einer Molekülmasse ≤600 Da, dazu zählen Zucker, Aminosäuren, Sterine, Hormone, Katecholamine, Hydroxylsäuren, Fettsäuren, Aromaten sowie weitere Zwischenprodukte des Primärstoffwechsels. Wegen ihrer hohen Trennleistung und guten Reproduzierbarkeit ist die GC/MS fester Bestandteil zahlreicher Metabolomics-Studien, schreiben die Wissenschaftler von der Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation (CSIRO), der in Australien für Wissenschafts- und Industrieforschung zuständigen staatlichen Behörde [4].

Beale und Karpe haben sich intensiv mit der Analyse von Zuckern, organischer und Aminosäuren im Rahmen von Hochdurchsatz-Metabolomics-Studien beschäftigt. Einen gesonderten Fokus richteten sie auf die Automatisierung der Probenvorbereitung und haben dabei einen Schlüssel zur In-time-Derivatisierung vor der GC/MS-Analyse gefunden. Die GC/MS lässt sich, urteilen Beale und Karpe, umfangreich automatisieren und eignet sich dazu, große Probensätze zu analysieren. Zudem stünden den Anwendern hinreichend viele etablierte Bibliotheken und Datenbanken sowie viele Metaboliten-Standards kommerziell zur Verfügung.

Mehrwert Automatisierung

Welche Bedeutung eine automatisierte Vorgehensweise hat, wird deutlich, wirft man einen Blick in den Analysenprozess von Metabolomics-Studien. Eine große Zahl der interessierenden Analyten ist nämlich nicht oder in nicht hinreichender Weise flüchtig.Um ihre GC-Gängigkeit, Thermostabilität und die chromatographische Auflösung sowie die Massenfragmentierung zu verbessern, wird die Probe derivatisiert, was sich im Fall vieler Metaboliten als zweistufiger Prozess darstellt [5].

Vereinfacht gesagt werden die Proben im ersten Schritt (Methoxymierung) nach ihrer Extraktion und Aufreinigung mit Methoxyamin-Hydochlorid (MeOX) versetzt, um Carbonylreste von Ketosäuren und Zuckern vor der im zweiten Schritt folgenden Silylierung von Analyten, die Carbonsäuren, Alkohole, Amine und Thiole enthalten, mit entsprechenden Reagenzien (BSTFA oder MSTFA) zu modifizieren, fassen Beale und Karpe zusammen. BSTFA etwa ist ein leistungsfähiger Trimethylsilyl-Donor, der bei einer breiten Palette von polaren Verbindungen labile Hydrogene durch eine -Si(CH3)3-Gruppe ersetzt und damit die Flüchtigkeit der Verbindung erhöht [6].

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