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Pipettieren Richtiges Pipettieren – Qualitätsmerkmal in den Life Sciences

Autor / Redakteur: Maria Zweig* / Dr. Ilka Ottleben

Kleine Fehler haben häufig eine große Wirkung – Pipettierfehler führen im Labor häufig dazu, dass Experimente nicht funktionieren oder nicht aussagekräftig sind. Lesen Sie, wie die GPP (Gute Pipettier-Praxis) dabei hilft, die Pipettiergenauigkeit und -wiederholbarkeit zu optimieren.

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Abb.1: Regelmäßige Pipettentests und fachkundige Wartung sind deshalb extrem wichtig, um sicherzustellen, dass Pipetten innerhalb der spezifizierten Toleranzen arbeiten.
Abb.1: Regelmäßige Pipettentests und fachkundige Wartung sind deshalb extrem wichtig, um sicherzustellen, dass Pipetten innerhalb der spezifizierten Toleranzen arbeiten.
(Bild: Mettler Toledo)

Unabhängig von der Sorgfalt der Durchführung liegt jeder Messung immer eine inhärente Fehlerwahrscheinlichkeit zugrunde. Niemand kann jemals exakt den wahren Wert einer Größe messen. Die Anzahl an Fehlern ist abhängig von der Präzision des Messgerätes, der richtigen Kalibrierung und der kompetenten Benutzung des Instrumentes. Das wichtigste Dosierinstrument in jedem Labor, welchem leider oft viel zu wenig Beachtung geschenkt wird, ist die Pipette.

Werden Pipetten nicht fachgerecht bedient und gewartet, entstehen im Laufe der Zeit viele unvorhersehbare Kosten. Studien belegen, dass über 30 % aller im Einsatz befindlichen Pipetten nicht innerhalb der erwarteten Toleranzen arbeiten. Akzentuiert durch die Fehlerpropagation in mehrstufigen Messprotokollen entstehen enorme Abweichungen der Messdaten. Inkonsistentes oder gar fehlerhaftes Pipettieren ist nicht nur ein wesentlicher Risikofaktor, welcher zu inakkuraten Daten oder nicht reproduzierbaren Ergebnissen führen kann, sondern auch ein nicht zu unterschätzender Kostenfaktor.

Funktionstests sind enorm wichtig

Ein einziger Elisa-Assay erfordert beispielsweise mehr als 1000 Pipettiervorgänge und jeder Mikroliter Reagenz kostet im Schnitt einen Dollar. Gibt nun die Pipette statt 1 μl fälschlicherweise 1,2 μl ab, kostet ein einfaches Experiment 20 % mehr als ursprünglich angenommen. Hinzu kommen Mehrkosten durch Überprüfung und Wiederholungen der Messungen.

Regelmäßige Pipettentests und fachkundige Wartung sind deshalb zwingend notwendig, um sicherzustellen, dass die Pipetten innerhalb der spezifizierten Toleranzen arbeiten.

Pipettieren als ganzheitlicher Prozess

Pipettieren ist viel mehr als das bloße Übertragen kleiner Flüssigkeitsmengen von A nach B, es ist ein ganzheitlicher Prozess, welcher allerdings nicht zu sehr simplifiziert werden darf. Im Idealfall umfasst das korrekte Pipettieren das gelungene Zusammenspiel von Instrument, korrekt gewähltem Zubehör und richtiger Technik.

Eine gründliche Evaluierung des Arbeitsablaufs und eine fundierte Auswahl von Liquid-Handling-Instrumenten sind dabei genauso wichtig wie die Kompetenz erfahrener und geschulter Anwender sowie die sorgfältige Pflege, die die Instrumente benötigen, um über Jahre hinweg zuverlässig zu arbeiten. Die Pipette ist zwar ein universelles Laborinstrument, aber jede Applikation und jede Probe erfordern mit ihren spezifischen Eigenschaften eine individuelle Berücksichtigung. Beispielsweise sollten bei molekulargenetischen Arbeiten nur auf absolute Reinheit geprüfte zertifizierte Spitzen verwendet werden. In einigen Labor-Verbrauchsmaterialien aus Polypropylen wurden nämlich Weichmacher nachgewiesen, die mit bestimmten Enzymreaktionen interferieren können und möglicherweise falsch-positive Spektrometerwerte bei 260/280 nm hervorrufen.

Die Anwendung strikter Standards ist eine entscheidende Voraussetzung für die Datenzuverlässigkeit – sowohl bei der Herstellung als auch bei der Qualitätskontrolle. Unablässig ist dabei die Prüfung auf potenzielle biologische Kontaminationen einschließlich der Tests auf Spuren von DNA, DNAse, Pyrogene und ATP. So werden z.B. die Rainin-Bio-Clean-Spitzen von Mettler Toledo mit einem Zertifikat geliefert, das die absolute Sauberkeit und Reinheit garantiert.

Anwendung entscheidet über Pipetten-Spitzen-Kombination

Der jeweilige Applikationstyp entscheidet darüber, welche Pipette ausgewählt werden sollte, um möglichst genaue Ergebnisse und eine möglichst hohe Produktivität zu erzielen.

Die Eigenschaften der zu pipettierenden Flüssigkeit können die Pipettierleistung und das Pipettierergebnis maßgeblich beeinflussen. Die meisten wässrigen Proben lassen sich bei Zimmertemperatur und mittlerem Luftdruck genauestens mit Luftverdrängungspipetten pipettieren. Problematische Flüssigkeiten wie viskose Medien, Flüssigkeiten hoher Dichte, flüchtige Verbindungen oder heiße und kalte Flüssigkeiten erfordern dagegen für ein exaktes Pipettieren Direktverdrängungspipetten.

Für die optimale Produktivität der Arbeitsabläufe kommt es in entscheidendem Maße auf die Wahl der korrekten Pipetten an. Der zunehmende Einsatz von 96-Well-Platten, die steigende Komplexität der heutigen Pipettieraufgaben und die strengen Anforderungen im regulatorischen Bereich machen dabei den Einsatz elek-tronischer Pipetten unabdingbar. Während manuelle Pipetten zwar kostengünstig, robust und einfach in der Bedienung sind, hängt ihre Leistung erheblich von der Pipettierkunst des Anwenders ab. Zudem sind die Ergebnisse im Vergleich zu elektronischen Pipetten weniger gut reproduzierbar. Die hoch auflösenden Schrittmotoren der elektronischen Pipetten schließen hingegen jegliche bedie-nerabhängige Unregelmäßigkeit aus und gewährleisten somit eine messbar höhere Genauigkeit und Wiederholbarkeit.

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Sicheres Einhalten regulatorischer Vorschriften

Labore, die strengen regulatorischen Auflagen unterliegen, müssen regelmäßig viele Aspekte und Parameter wie die Einhaltung von Service-Intervallen überprüfen und kontrollieren. Die Radiofrequenz-Identifikation (RFID)-Technologie ermöglicht dabei die automatische Identifizierung der Pipette und erleichtert erheblich die Erfassung von Daten wie Seriennummer, Herstellungsdatum, Datum der nächsten Kalibrierung usw. In den Pipetten der neuesten Generation ist ein RFID-Chip eingebettet, der das sichere Einhalten der regulatorischen Vorschriften gewährleistet. In den regulierten Bereichen wird jeder Arbeitsablauf nach einer vordefinierten Standardprozedur (SOP) durchgeführt. Wie kann aber sichergestellt werden, dass Mitarbeiter genau nach dem vorgeschriebenen Protokoll arbeiten und von diesem nicht abweichen? Die neuen elektronischen Pipetten wie die E4 XLS+ von Mettler Toledo verfügen eigens über erweiterte Verwaltungs- und Sicherheitsfunktionen, welche regulierte Labore beim Einhalten entsprechender Vorschriften sowie der Pipettenverwaltung unterstützen. Der passwortgeschützte Admin-Modus definiert dabei Pipetteneinstellungen, Protokolle und Wartungsintervalle nach GLP-/GMP-Konformität. Manipulationssicher sind auch GLP-Daten wie etwa Zyklen und Statusdaten oder Wartungsdatensätze.

Ergonomische Lösungen für nachhaltigen Erfolg

Pipettierergebnisse sind so gut wie es die Technik erlaubt. Insbesondere beim Arbeiten mit kleinen Volumina sind die Ergebnisse entscheidend vom Stand der Technik abhängig. Jede Änderung beim Ausführen wiederholter Pipettierzyklen kann sich in der Genauigkeit und Präzi-sion bemerkbar machen. Ermüdung oder Schmerzen können beispielweise einen Anwender dazu bringen, den Pipettierrhythmus zu variieren.

Die Ergonomie beim Pipettieren beeinflusst aber nicht nur das Wohlbefinden, sondern auch die Genauigkeit und Präzision sowie in der Folge die Reproduzierbarkeit der Experimente.

Ergonomisch ausgereifte Pipetten zeichnen sich z.B. dadurch aus, dass sie leicht und gut ausbalanciert sind sowie intuitiv und mit minimalem Kraftaufwand zu bedienen sind. Die Ergonomie ist dann spürbar gegeben, wenn selbst bei stundenlangen ununterbrochenen Pipettiersequenzentests der minimale Kraftaufwand für den Anwender gewährleistet ist. Es ist wichtig, mit Pipetten zu arbeiten, die aus leichten hochwertigen Materialien hergestellt wurden, bei denen Pipettierkräfte auf ein Minimum reduziert sind und der Kraftaufwand beim Spitzenaufsetzen und -abwerfen minimal ist. Die meisten Pipetten arbeiten mit zwei Federn. Die erste dient zum Aspirieren und Dispensieren der Probe, die zweite zum Ausblasen der Pipetten-Spitze. Damit der Anwender den ersten Stopp-Punkt zwischen Aspirations- und Ausblasposition sicher spüren und halten kann, weist die zweite Feder einen erheblich höheren Widerstand auf. Eine Verringerung dieser Federkraft würde zu einem für den Bediener schlechter wahrnehmbaren ersten Stopp und somit zu einer deutlich geringeren Präzision und Genauigkeit beim Pipettieren führen. Eine innovative Lösung bietet Mettler Toledo mit der Magnetic-Assist-Technologie (Magnetunterstützung), die eine deutliche Reduzierung der Federkräfte für das Aspirieren/Dispensieren und den Ausblasvorgang erlaubt, ohne die Genauigkeit zu beeinträchtigen. Zu den kraftintensivsten Arbeitsschritten beim Pipettieren zählen das Aufstecken und Abwerfen der Spitzen – dazu können Kräfte von mehreren Kilogramm erforderlich sein. Das LTS (Lite-Touch)-Spitzenabwurf-System von Mettler Toledo mit dem zylindrischen Design für Schaft und Pipettenspitze anstelle des konventionellen konischen vermindert die Kontaktoberfläche zwischen Schaft und Pipette erheblich und garantiert eine sichere Dichtigkeit. Vergleichsuntersuchungen von konventionellen Spitzen und LTS-Design zeigten, dass für das Aufstecken und Abwerfen von LTS-Spitzen lediglich ein Kilogramm, für das von konventionellen Spitzen jedoch mehrere Kilogramm erforderlich sind.

Jede neu produzierte Pipette wird vom Hersteller Mettler Toledo vor der Auslieferung kalibriert und entspricht damit den Vorgaben bezüglich Volumen, Richtigkeit und Präzision. Die Kalibrierung wird mit den Herstellerspitzen durchgeführt, denn nur die optimale Passform der Spitze garantiert die bestmögliche Präzision und Genauigkeit. Da Pipette und Spitze eine Einheit bilden, ist es zudem ratsam, für die höchste Zuverlässigkeit der Messdaten ausschließlich Herstellerspitzen zu verwenden und die Pipetten direkt bei einem zuverlässigen, akkreditierten Kalibrierlabor kalibrieren zu lassen.

* *Dr. M. Zweig: Mettler-Toledo, 35396 Gießen

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