Effizient automatisiert Vitamine bestimmen Säuglingsnahrung: Nur das Beste für die Besten?

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Gerstel GmbH & Co. KG

Redaktionsbüro Guido Deußing

Weil der Gesetzgeber die Kleinsten der Kleinen als besonders schützenswert erachtet, hat Säuglingsnahrung sehr hohe Qualitätsstandards zu erfüllen. Eingesetzte Rohstoffe spielen eine wichtige Rolle, ebenso Analyselabore, die helfen, gesetzliche Vorgaben sicher, zuverlässig und obendrein höchst effizient und ökonomisch zu überprüfen.

Wenn es um die Ernährung unserer Jüngsten geht, empfiehlt die Weltgesundheitsorganisation (WHO), Babys in den ersten sechs Lebensmonaten zu stillen [1, 2]. Von Ausnahmen ist die Rede, wenn mit Muttermilch allein die Ernährungsbedürfnisse des Kindes nicht oder nicht hinreichend befriedigt würden. Bei Frühgeborenen oder Säuglingen mit niedrigem Geburts­gewicht sowie bei Kindern von mangelernährten Müttern könne laut WHO die Verabreichung mit Mineralstoffen und Vitaminen angereicherter Bei- oder Ersatzkost angezeigt sein.

Während man Muttermilch im Grunde ungeprüft gesundheitliche Unbedenklichkeit attestiert, ist dies bei industriell gefertigten Ersatzprodukten erst im Zuge einer entsprechend verlaufenden Qualitätskontrolle zulässig. Jeder Herstellungsprozess sowie die Lagerung und der Transport von Lebensmitteln birgt gewisse Risiken, die sich zwar minimieren, nicht aber ganz ausschließen lassen. Dazu zählt der Eintrag von Chemikalienrückständen oder Schadkeimen ins Produkt durch belastete Roh- und Hilfsstoffe oder Prozesskontaminanten [3]. Nicht zuletzt ist die Frage zu beantworten, ob die Ersatznahrung in hinreichender Weise mit jenen Nährstoffen und Vitaminen angereichert ist, die für ein gesunde Entwicklung des Kindes erforderlich sind.

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Kontrollinstanz Analytik

Aufgrund ihrer Bedeutung für die Gesundheit und das Wachstum von Babys ist die Herstellung und Analyse von Säuglingsnahrung sowie ihren Bestandteilen weltweit reguliert. Produzenten und die mit der Analyse beauftragten Laboratorien sind verpflichtet, gesetzliche Vor­gaben zu befolgen. Messergebnisse müssen genau und reproduzierbar sein. Die große Nachfrage nach Säuglingsnahrung erzeugt folglich ihrerseits einen nicht unerheblichen Bedarf an gleichsam sicheren und zuverlässigen sowie hinreichend empfindlichen und auch effizienten Analysenmethoden, die einen hohen Probendurchsatz ermöglichen und den Zeitraum zwischen Probeneingang und dem Vorliegen verwertbarer Messresultate kurzhalten.

In Zusammenarbeit mit Dan Hengst und Gretchen Foltz von der Eurofins Food Integrity and Inno­vation in Madison/USA, einem Kompetenz-Zentrum der Eurofins-Gruppe, das sich mit der Prüfung der Echtheit, Unverfälschtheit und Qualität von Lebensmitteln und deren Zutaten beschäftigt, haben sich die Applikationsexperten Fred Foster und John Stuff der ebenfalls in den Vereinigten Staaten von Amerika (Baltimore) ansässigen Gerstel Inc. damit beschäftigt, den HPLC-Nachweis verschiedener Vitamine in Säuglingsnahrung gemäß den Vorschriften der „Association of Official Agricultural Chemists“ (AOAC 2012.19 und 2015.09) zu automatisieren. Ziel sei es gewesen, berichten Foster et al., sowohl die analytischen Vorgaben der AOAC zu erfüllen als auch die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit der Daten zu verbessern sowie den ökonomischen Anforderungen der Laboratorien zu genügen [4].

Effizient automatisieren

Wer die Effizienz eines sicheren und zuverlässigen manuellen oder teilautomatisierten analytischen Prozederes steigern will, kommt heutzutage an der Digitalisierung zentraler Prozesse kaum vorbei, v .a. aber nicht am damit qua Steuerung und Nachverfolgbarkeit verbundenen Einsatz leistungsfähiger Laborroboter. Sie bilden die Basis für eine höhere, kosteneffiziente Laborleistung. Wir wollen nicht über Digitalisierung sprechen, die unter anderem Thema der LP-Mai-Ausgabe „Labor 4.0“ war, sondern über die Automatisierung von Analyseprozessen, im vorliegenden Fall der Bestimmung der Vitamine A, E und K1 in Säuglingsnahrung. Eine Prämisse war, berichten Foster et al., die Durchlaufzeit vom Probeneingang bis zum berichteten Ergebnis zu verkürzen. Das wiederum setze ein intelligentes Probenhandling voraus sowie den Einsatz eines Autosamplers, um die Probenvorbereitung, die sich je nach Proben­matrix und Analysenziel, überaus arbeits- und zeitintensiv gestaltet.

Für Foster et al. zeichnete sich in diesem Kontext ein zentraler Angriffspunkt ab, und zwar die Flüssig-Flüssig-Extraktion der Analyten und deren Überführung in eine HPLC-gängige Form. Die AOAC-Methoden sehen, erläutern die Experten, die Quantifizierung von Vitamin-A-Palmitat, Vitamin-A-Acetat, Vitamin-E-Acetat, α-Tocopherol (AOAC Offical 2012.19) und Vitamin-K1 (AOCA Offical 2015.09) in Säuglings-, Kinder- und Erwachsenennahrung vor. Die Proben werden zunächst mit Methanol gemischt, um Proteine und freie Lipide für die Extraktion auszufällen (präzipitieren), um dann die Vitamine mit Isooctan zu extrahieren. Die Isooktan-Schicht wird von der Alkohol- Wasser-Schicht abgetrennt und ein Aliquot davon zur Analyse injiziert. Klingt simpel, ist es aber nicht. Für Foster et al. bestand die Heraus­forderung u. a darin, „die Flüssig- Flüssig-Extraktion von Vitaminen in Säuglingsnahrung zu automatisieren und zugleich genaue und präzise Daten zu erhalten".

Experimentelle Details

Foster et al. untersuchten im Rahmen der Methodenentwicklung pulverförmige Säuglingsnahrung, die von Eurofins zur Verfügung gestellt wurde und die durch An­mischen mit Wasser verzehrfähig gemacht wird. Stammlösungen von Vitamin A-Palmitat (1.000 μg/mL), Vitamin A-Acetat (200 μg/mL), Vitamin E-Acetat (1 mg/mL), α-Tocopherol (1 mg/mL) und Vitamin K1 (220 μg/mL) wurden mit zertifizierten Standards in Isooctan angesetzt. Zur Analyse kam Nahrungsmittelpulver wie auch rekonstituierter, sprich mit Wasser (HPLC Grade) angerührter Nahrungsbrei. Während der Vorbereitung, Extraktion und Analyse habe man darauf geachtet, schildern die Applikationsexperten, dass die Proben in Behältern aus Braunglas aufbewahrt und vor Licht geschützt waren. Sechs Replikate der pulverförmigen wie auch der rekonstituierten Säuglingsnahrungsproben seien zur Bestimmung der Mess- und Methodengenauigkeit an drei unterschiedlichen Tagen extrahiert worden.

Roboter im Einsatz

Foster et al. verwendeten für die Automatisierung der Probenvor­bereitungen einen Multi-Purpose-Sampler (Gerstel-MPS robotic pro) als Workstation, sprich nicht angebunden an das zur späteren Analyse eingesetzte HPLC-System (Agilent HPLC Serie 1200) mit UV- und Fluoreszenzdetektion. Die Trennung der Analyten erfolgte auf einer Thermo Fisher Betasil 100 Si-60 Analysesäule (3,0 x 200 mm, 3 μm). Die experimentelle Phase machte laut Foster et al. den großen Einfluss einer zuverlässig und gründlich verlaufenden Mischung von Probe und Zutaten sowie im Weiteren der für die Flüssig-Flüssig-Extraktion der Analyten eingesetzten Chemikalien deutlich. Sie erfolgte in der von ihnen entwickelten Methode automatisch mittels eines leistungsstarken Mixers (Gerstel-quick-Mix), der sich optional in die Sampler-Umgebung einbinden lässt. Für die Trennung des resultierenden Mehrphasensystems wurde eine Zentrifuge (Gerstel-CF 200) in den automatisierten Probevorbereitungszyklus integriert. Blicken wir auf einige wichtige Details:

A und O: gründliches Mischen

Vitamin A und E: Der MPS gibt 0,700 mL Wasser zur pulverförmigen Probe (0,0875 g), keines jedoch zur rekonstituierten Probe. Die Probe wird geschüttelt und durchmischt (30 s, 1.500 U/min). 4,375 mL Methanol werden in mehreren Hüben hinzu dosiert und die Probe nach jeder Zugabe gemischt (30 s, 1.500 U/min). Es folgt eine zehnminütigen Absetzphase, dann die Hinzugabe von 1,750 mL Isooktan (mischen 45 s,1.500 U/min), gefolgt von 0,875 mL Wasser (mischen 20 s, 1.500 U/min). Durch Zentrifugation schließt sich die Phasentrennung (10 min, 3.000 U/min) an. Aus dem Überstand entnimmt der MPS 0,5 mL und dosiert die Isooktanlösung in ein sauberes, bernsteinfarbenes 2-mL-Vial.

Vitamin K1: Der MPS fügt der pulverförmigen Probe (0,0438 g) 0,700 mL Wasser und der rekonstituierten Probe 0,350 mL Wasser zu. (Mixen 30 s, 1.500 U/min). Der Sampler dosiert insgesamt 4,375 mL Methanol in mehreren Schüben hinzu, verbunden mit jeweils einer Durchmischung (30 s, 1.500 U/min). Es folgt eine zehnminütige Absetzphase. Der MPS gibt 1,750 mL Isooktan zur Probe (mischen für 45 s bei 1500 U/min), dann 0,875 mL Wasser (mischen 20 s bei 1.500 U/min). Die Phasentrennung erfolgt durch Zentrifugation (10 min, 3.000 U/min.). Zur weiteren Verwendung dosiert der MPS 0,5 mL des Isooktan-Überstandes in ein sauberes, bernsteinfarbenes 2-mL-Autosamplervial.

Resultate auf einen Blick

Als Ergebnis ihrer Studie hätten sie zeigen können, berichten Foster et al., dass „sich Flüssig-Flüssig-Extraktionen, wie sie in den ‚AOAC Official Methods 2012.09‘ und ‚2015.09‘ zu finden sind, problemlos automatisieren lassen". Die Extraktion der Vitamine K1, A und E aus (pulverförmiger und rekonstituierter) Säuglingsnahrung mit der von den Applikationsexperten entwickelten automatisierten Methode habe sich als akkurat und präzise herausgestellt. Die Genauigkeit der Vitaminbestimmung in der als Pulver vorlegten Säuglingsnahrung habe demnach im Bereich von 96,2 und 101 Prozent gelegen, die Standardabweichung (RSD) zwischen 0,8 und 2,1 Prozent.

Für die rekonstituierte Säuglingsnahrung habe die Analysengenauigkeit bei durchschnittlich 99,2 Prozent gelegen; die ermittelten Werte rangierten zwischen 97,5 und 101 Prozent. Die Standardabweichung wurde im Mittel mit 1,14 Prozent angegeben, wobei sich die Bandbreite von 0,7 bis 2,1 Prozent erstreckt habe. Als für die spätere Anwendung des von ihnen entwickelten und validierten automatisierten Probenvorbereitungsszenario zum Nachweis der Vitamine A, E und K1 interessant erachten Foster et al., dass es sich offline durchführen lasse, also losgelöst von dem jeweils nachfolgenden Analyse­verfahren, aber eben auch online-gekoppelt an ein HPLC-System der Wahl, was dem Anwender in Anwendung und Ausführung ein Maximum an Flexibilität biete.

Quellen:

[1] Word Health Organization (WHO), Guiding Principles For Complemnetary Feeding of the Breastfeld Child, https://www.who.int/nutrition/publications/guiding_principles_compfeeding_breastfed.pdf

[2] Still-Lexikon, Impfprotal rund ums Stillen, https://www.still-lexikon.de/impressum/

[3] Karsten Schwarz, Carlos Gil und Oliver Lerch, Mineralölfrei?, Laborpraxis 3 (2020) 34-37, https://www.laborpraxis.vogel.de/moshmoah-analyse-mineraloel-basierte-kohlenwasserstoffe-in-lebensmitteln-a-918159/

[4] Fred D. Foster, Dan Hengst, Gretchen Foltz und John R. Stuff, Automated Liquid-Liquid Extraction of Vitamins in Infant Formula using a Bench-top Workstation, GERSTEL Application 222 (2021), http://www.gerstel.de/pdf/AppNote-222.pdf

* G. Deußing, Redaktionsbüro Guido Deußing, 41464 Neuss

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