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Fluoreszenzspektrometrie Schnelle Fluoreszenzspektrometrie für die Wasseranalytik

Autor / Redakteur: Rainer Nehm* und Peter Herzsprung** / Dr. Ilka Ottleben

Wasser gehört zu den wichtigsten Gütern der Menschheit und unterliegt in weiten Teilen der Erde einer intensiven Kontrolle. Ein neues Fluoreszenzspektrometer ermöglicht nun die besonders schnelle Analyse organischer Verbinungen im Rahmen der Wasseranalytik.

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(Bild: Horiba Jobin Yvon/UFZ)

Gut 71% der Erdoberfläche sind von Wasser bedeckt, 65% des menschlichen Gesamtkörpergewichtes besteht aus Wasser – Wasser ist elementar für alle Stoffwechselvorgänge und zählt in Form von Trinkwasser zu den wichtigsten Gütern jeder Gesellschaft. Daher unterliegt es einer strengen und intensiven Kontrolle. Die Analyse und die damit zu bestimmenden Parameter richten sich nach der Klassifizierung des Wassers (Trinkwasser, Abwasser, Mineralwasser, etc.). So unterliegt in Deutschland das Trinkwasser der Trinkwasserverordnung, in der die Überwachung einer ganzen Reihe von Parametern geregelt ist. Hierzu zählen neben so genannten Indikatorparametern (Färbung, Geschmack, elektrische Leitfähigkeit, etc.) auch mikrobiologische (Enterokokken, coliforme Bakterien, etc.) und chemische Parameter. Neben in Wasser gelösten Metallen wie Cadmium, Blei, Chrom und Nickel sind auch anionische Bestandteile wie Bromat, Fluorid oder Nitrat und zudem organische Verbindungen wie Benzol, Pflanzenschutzmittel und Biozidprodukte zu bestimmen.

Die Überwachung organischer Komponenten in Gewässern nimmt dabei einen immer höheren Stellenwert ein. Wasser fließt durch die Natur und transportiert dadurch gelöste organische Substanzen (CDOM; chromophoric dissolved organic matter). Diese stammen aus unterschiedlichsten Quellen und hierdurch bedingt variiert sowohl die Zusammensetzung als auch die Konzentration dieser CDOM. Neben dem naturgegebenen Eintrag organischer Komponenten in aquatische Systeme spielt der Eintrag von organischen Komponenten durch den Menschen eine immer größere Rolle. Als wichtige Eintragsquellen sind hier die Landwirtschaft, der Einsatz organischer Chemikalien in der Industrie sowie der unumgängliche Einsatz von Arzneimitteln zu nennen.

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Die Konzentrationen der CDOM im Wasser und ihre anteilsmäßige Verteilung sind großen Schwankungen unterworfen. Ein wesentlicher Einflussfaktor ist z.B. die Probennahme. In Abhängigkeit vom Ort und Zeitpunkt der Probennahme kann die Konzentration und die chemische Zusammensetzung stark schwanken. Die ursprüngliche Zusammensetzung unterliegt aber weiteren Variationen, da verschiedene chemische, photochemische und biologische Prozesse wie Fäulnis die Grundzusammensetzung verändern können.

Schnelles Spektrometer für die Wasseranalytik

Eine Technik zur Analyse organischer Substanzen stellt die Fluoreszenzspektroskopie dar. Ein wesentlicher Vorteil der Fluoreszenzspektroskopie ist, dass keine größeren Probenvorbereitungsschritte wie Festphasenextraktion oder Derivatisierungen nötig sind.

Mit dem Aqualog (s. Abb. 2) hat Horiba Scientific ein neues schnelles Fluoreszenzspektrometer entwickelt und auf den Markt gebracht, das speziell an die Bedürfnisse der Analytik von Wasserproben angepasst wurde. Neu und einzigartig ist, dass zur notwendigen Korrektur des so genannten inneren Filtereffektes das Absorptionsspektrum simultan mit dem Emissionsspektrum erfasst wird. Der innere Filtereffekt ist bei der Fluoreszenzspektroskopie eine grundsätzlich auftretende Begleiterscheinung [1], da andere Moleküle um die eingestrahlten Photonen konkurrieren können (primärer innerer Filtereffekt) und die generierte Fluoreszenzstrahlung auf ihrem Weg durch die Probe wieder absorbiert werden kann (sekundärer innerer Filtereffekt). Somit wirkt die fluoreszenzfähige Probe gleichzeitig auch als Filter. Das Absorptionsspektrum wird mithilfe einer Si-Fotodiode aufgenommen. Das Emissionsspektrum wird von einem CCD-Detektor bestimmt, der ca. 100-mal schneller arbeitet als herkömmliche Fotomultiplier.

Je nach Applikation stehen dem Anwender unterschiedliche Modelle zur Verfügung. Sie unterscheiden sich sowohl im Anregungs- als auch im Emissionswellenlängenbereich. So stehen Modelle mit einer Anregungswellenlänge ab 230 nm als auch ab 200 nm ebenso zur Verfügung wie Modelle mit einem nutzbaren Emissionswellenlängenbereich bis 620 nm bzw. 800 nm. Grundsätzlich ist das Aqualog für die schnelle Detektion der Anregungs-Emissions-Matrix (EEM; excitation emission matrix) ausgelegt. Die EEM erlaubt, mithilfe einer multivariaten Datenanalyse wie PARAFAC [2] eine quanti- und qualitative Bestimmung organischer Komponenten in den Proben. Handelt es sich dabei um Proben mit einer bekannten (und begrenzten) Anzahl organischer Moleküle, deren Struktur bekannt ist, so kann die Konzentration der einzelnen fluoreszierenden Substanzen mithilfe von PARAFAC direkt berechnet werden. Falls in einer Probe natural organic matter (NOM) untersucht wird, so ist klar, dass Struktur, Diversität und Quantenausbeute fluoreszierender organischer Moleküle nicht bekannt sein können. Es können aber Komponenten gefunden werden, die bestimmten Strukturmerkmalen aus verschiedenen Stoffgruppen zugeordnet werden können. Die Strukturmerkmale können z.B. durch ein anderes, sehr aufwändiges und teures Analysenverfahren wie der Pyrolyse-GC/MS durch Korrelationsrechnung den PARAFAC-Komponenten zugeordnet werden [3].

Neben der hohen Analysengeschwindigkeit zeichnet sich das Aqualog durch eine sehr gute Empfindlichkeit und damit sehr geringe Nachweisgrenzen aus. Ein wichtiges Qualitätskriterium für Fluoreszenzspektrometer, das Signal-Rausch-Verhältnis, ist mit 20000:1 spezifiziert (gemessen am Wasser-Raman-Signal bei 350 nm Anregung, 397 nm Emission und 5 nm Bandpass). Eine spektrale Kalibrierung sowohl für den Emissions- als auch für den Transmissionsdetektor basiert auf NIST-Standards. Somit ist mit den korrigierten Daten ein Vergleich mit anderen Messdaten sofort möglich. Auch wenn das Aqualog für die Wasseranalytik entwickelt wurde, können mit dem Spektrometer selbstverständlich auch andere Proben analysiert werden.

Einsatz des Aqualog bei der Untersuchung von Moorwasser

Exemplarisch für den Einsatz des Aqualog-Fluoreszenzspektrometers in der Wasseranalytik werden begleitende Untersuchungen im Blumentopfmoor (s. Abb. 1, rechts) im Oberharz vorgestellt. Das Projekt zielt auf eine ganzheitliche ökologische Betrachtung, wie sich die Vegetation und die Qualität eines Moores durch eine gezielte Wiedervernässung verändert. Dabei tragen die Ergebnisse der Fluoreszenzspektroskopie zum Gesamtbild bei, das durch weitere Parameter wie DOC (dissolved organic carbon = gelöster organischer Kohlenstoff), UV 254 nm (Summenparameter für CDOM) oder SUVA (specific UV absorption, UV in Relation zum DOC, der Parameter beschreibt die Aromatizität der Probe) komplementiert wird. Im Rahmen dieses Projektes werden Zuläufe, Abläufe, Gräben und direkte Standorte des Moores beprobt. Insgesamt gibt es sieben verschiedene Standorte als fixe Probennahmestellen. An sechs von diesen Probennahmestellen sind jeweils vier so genannte Piezometerrohre installiert (s. Abb. 1, links), aus denen Wasser aus mehreren Zentimetern Tiefe für die Analysen entnommen wird. An einem Standort ist nur ein Rohr installiert, während vier jeweils nicht weit voneinander entfernte Rohre helfen, die Reproduzierbarkeit eines Standorts zu überprüfen. Nach den Probenahmen wird das Wasser filtriert (0,45-µm-Membranfilter) und i.d.R. für die Fluoreszenzmessungen (wegen des hohen DOC-Gehaltes im Moorwasser zur Abschwächung des inneren Filtereffekts) im Verhältnis 1:2 verdünnt.

Das ausgewählte Beispiel zeigt, dass die Qualität des CDOM an einem Standort durchaus variieren kann (s. Abb. 3). Die Proben 22 und 23 (Probe 22: 21,3 mg/L DOC, Probe 23: 22 mg/L DOC) gehören zu einem Standort, der wieder vernässt wurde (einer der sieben Standorte war schon immer nass, alle anderen wurden ursprünglich trockengelegt). Die Probe 23 zeigt ein für CDOM übliches Spektrum mit Huminstofffluoreszenz (hierbei handelt es sich um aromatische, relativ ungesättigte und sauerstoffreiche Huminstofffraktionen) [4] und geringe Anteile Fluoreszenz von Proteinen. Die Probe 22 zeigt eine bisher in dieser Form noch nicht beobachtete Struktur der EEM. Die Proteinfluoreszenz bei 280 nm Anregung und 310 nm Emission ist noch gut zuzuordnen. Bemerkenswert ist, dass die Anomalität des Spektrums einen Monat später reproduziert werden konnte (Mai – Juni).

Mit dem Beispiel kann gezeigt werden, dass sich EEM-Komponenten in der Intensität räumlich und zeitlich ändern können. Das Beispiel aus diesen Parallelstandorten zeigt weiter, dass die CDOM-Qualität nicht statistisch über Raum und Zeit variieren muss, sondern dass definierte Teilstandorte einen Wiedererkennungswert besitzen können.

Der molekulare Hintergrund dieser Spektren ist natürlich nicht ohne weiteres zugänglich. Um diesen etwas tiefer zu entschlüsseln, würde es weiterer Untersuchungen beispielsweise per PARAFAC-Modellierung bedürfen. Mit dieser Modellierung wird eine Unterteilung in etwa vier bis zehn unterschiedliche Komponenten ermöglicht, die in der internationalen Literatur [3, 5] grob strukturchemisch und auch ökologisch zugeordnet werden (humic-like, fulvic-like, protein-like, tyrosin-like, tryptophan-like, terrestrial, allochthonous, autochthonous, polyphenol-like). Eine Zuordnung zu organischen Einzelverbindungen ist für NOM aus heutiger Sicht unrealistisch, da nicht auszuschließen ist, dass Tausende oder gar Millionen verschiedene Fluorophore zu einem NOM-EEM beitragen könnten [4].

Dennoch ist zu erwarten, dass eine PARAFAC-Modellierung mithilfe eines großen Probensatzes einen detaillierteren Einblick in CDOM-Qualitätsunterschiede bieten kann.

Literatur

[1] MacDonald, B.C., Lvin, S.J., Patterson, H. Correction of fluorescence inner filter effects and the partitioning of pyrene to dissolved organic carbon. Anal. Chim. Acta 338, 155-162 (1997).

[2] Stedmon, C.A., Bro, R. Characterizing dissolved organic matter fluorescence with parallel factor analysis: a tutorial. Limnol. Oceanogr.-Met., 6, 572-579 (2008).

[3] Fellman, J.B., Miller, M.P., Cory, R.M., D'Amore, D.V., White, D. Characterizing dissolved organic matter using PARAFAC modeling of fluorescence spectroscopy: A comparison of two models. Environ. Sci. Technol. 43, 6228-6234 (2009).

[4] Herzsprung, P., von Tümpling, W., Hertkorn, N., Harir, M., Büttner, O., Bravidor, J., Friese, K., Schmitt-Kopplin, P. (2012) Variations of DOM quality in inflows of a drinking water reservoir: Linking of van Krevelen diagrams with EEMF spectra by rank correlation. Environ. Sci. Technol. 46, 5511-5518 (2012).

[5] Murphy, K.R., Stedmon, C.A., Waite, T.D. Distinguishing between terrestrial and autochthonous organic matter sources in marine environments using fluorescence spectroscopy. Marine Chem. 108, 40 – 58 (2008)

* Dr. R. Nehm: HORIBA Jobin Yvon GmbH, 82008 Unterhaching, Tel. +49-89-462317-82

* *Dr. P. Herzsprung: Department Lake Research, Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung GmbH - UFZ, 39114 MagdeburgBesonderer Dank gilt Frau Katja Osterloh, Universität Halle, für die Bereitstellung der Proben und der wissenschaftlich-ökologischen Fragestellung.

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