Enantiomere sicher unterscheiden Schnelle Methodenentwicklung zur Trennung chiraler Substanzen

Die Trennung von chiralen Komponenten ist seit den 1980er Jahren ein Kern­anwendungsgebiet der Chromatographie mit überkritischen Fluiden (SFC). Moderne Systeme unterstützen den Anwender heutzutage bei der schnellen und effizienten Methodenentwicklung und somit auch dabei, neue Methoden für die Trennung pharmazeutischer Substanzen schnell zu etablieren.

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Chiralität ist in der Natur allgegenwärtig. So wie wir unsere Hände nicht deckungsgleich übereinander legen können, kann auch der Aufbau von Molekülen so sein, dass sie durch ihre chiralen Stereozentren nicht deckungsgleich mit ihren Spiegelbildern sind.

Auch in der Biochemie spielt die Chiralität von Molekülen eine große Rolle. Nahezu jede natürlich vorkommende organische Verbindung ist chiral. So kommt zum Beispiel Zucker in der Natur ausschließlich als D-Glucose und nicht als L-Glucose vor. Auch die Aminosäuren, die zum Aufbau von Proteinen, basierend auf der Sequenz von DNA bzw. RNA verwendet werden, sind chiral. Des Weiteren verfügen viele Enzyme über Mechanismen, die jeweils nur eine bestimmte chirale Form eines Moleküls erkennen können.

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Enantiomere – von harmlos bis toxisch

Doch die Chiralität beinhaltet mehr als einen geometrischen Unterschied. Enantiomere, die unterschiedlichen Versionen einer chiralen Verbindung, können sich auch in ihren Eigenschaften unterscheiden. Die Enantiomere pharmazeutischer Verbindungen variieren dabei von eher harmlosen Eigenschaften wie Geschmack und Geruch, bis hin zu drastischen Veränderungen in Toxizität oder pharmakologischer Wirkung. So kann ein Enantiomer ein ausgezeichnetes Pharmazeutikum sein, während das andere Isomer biologisch inaktiv oder im schlimmsten Fall sogar schädlich für den Patienten ist. Das prominenteste Beispiel dafür ist sicherlich Thalidomid (Contergan) (s. LP-Tipp).

Diese möglichen Unterschiede machen die zuverlässige Analyse und Trennung von chiralen pharmazeutischen Substanzen zu einer unbedingten Notwendigkeit für die Arzneimittel- und Patientensicherheit – während der Entwicklung neuer Therapeutika, aber auch in der Qualitätskontrolle von bestehenden pharmazeutischen Produkten.

SFC für die Analyse chiraler Verbindungen

Seit ihrer Einführung in den 1980er Jahren wurde die SFC (supercritical fluid chromatography) aufgrund ihrer überragenden Eigenschaften gegenüber der herkömmlichen HPLC für die Trennung von chiralen Verbindungen verwendet. Überkritische Fluide vereinigen die Eigenschaften von Flüssigkeiten und Gasen und ermöglichen durch ihre niedrige Viskosität und gute Löslichkeit eine schnelle Chromatographie mit sehr guten Trenn­eigenschaften.

Das als mobile Phase verwendete Kohlendioxid ist zudem einfach verfügbar, ungiftig und inert. SFC bietet also nicht nur die Möglichkeit, schnelle Analytik zu betreiben, sondern reduziert auch Lösungsmittelverbrauch und Kosten. Zusammen mit organischen Modifiern können Gradientenelutionen erstellt werden, die den klassischen Normalphasentrennungen ähneln, sodass die SFC Analyten mit einem weiten Polaritätsbereich zugänglich macht.

Gerade bei chiralen Trennungen überzeugen SFC-Methoden durch ihre überragende Trennschärfe und kurze Analysendauer. Im Gegensatz zu den älteren Gerätegenerationen bieten die aktuellen Modelle, wie das Nexera-UC-Chiral-Screening-System (Shimadzu, Kyoto/Japan) zusätzlich eine dezidierte Software zur Methodenerstellung und -optimierung. Dabei kann automatisiert zwischen bis zu elf verschiedenen Säulen und vier verschiedenen Modifiern gewechselt werden, um die für die konkrete Anwendung optimale Kombination zu finden. Dies ist gerade bei chiralen Trennungen besonders nützlich, da hier die Retentionsmechanismen auf den einzelnen chiralen Säulen nur schwer vorhersagbar sind.

Besonders für die Forschung und Entwicklung von Wirkstoffen ist eine schnelle Methodenentwicklung notwendig, da bei neu entwickelten Pharmazeutika nicht auf bereits etablierte Methoden zurückgegriffen werden kann und die Wahl der richtigen chromatographischen Säule und analytischen Bedingungen für eine geeignete Trennung neu optimiert werden muss.

Method Scouting für pharmazeutische Wirkstoffe

Für die Analyse von fünf unbekannten pharmazeutischen Wirkstoffen (API, ac­tive pharmaceutical ingredient) wurde ein Shimadzu-Nexera-UC-Chiral-Screening-System verwendet. Neben einer CO₂-Pumpe und einer quarternären Modifierpumpe bestand das System aus einem Autosampler mit Loop-Injektion, einem Säulenofen mit Säulenschaltventil zur Ansteuerung von sechs verschiedenen Säulen und einem Rückdruckregulator. Die Detektion erfolgt mit einer Kombination aus einem Photodiodenarray-Detektor und einem LCMS-8040-Triple-Quad-Massenspektrometer. Die Steuerung der Anlage sowie die Datenauswertung erfolgten mithilfe der Labsolutions-Software, Version 5.82. Die Erstellung der Methode und der Sequenz erfolgte mit dem speziellen Software-Add-On Method Scouting Solutions (s. Abb. 4, online). Für die konkrete Methodenentwicklung über Nacht wurde eine Sequenz von Gradientenläufen mit einer Dauer von 6 min bei einer Temperatur von 40 °C bei einem Rückdruck von 150 bar und einer Flussrate von 2 ml/min erstellt.

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Die Trennung erfolgte auf den folgenden Säulen der Firma Phenomenex mit den Abmessungen 250 x 4,6 mm und einer Partikelgröße von 5 µm: Lux Amylose-1, Lux-Amylose-2, Lux Cellulose-1, Lux Cellulose-2, Lux Cellulose-3 und Lux Cellulose-4. Als Modifier wurden Methanol und Methanol mit einem Zusatz von 0,1 % Ameisensäure verwendet.

Für die Detektion wurde mittels Photodiodenarray-Detektion ein Spektrum über 190 bis 70 nm aufgezeichnet, um die massenspektrometrischen Signale zu verifizieren. Für die MS-Detektion wurde ESI-Ionisation im positiven Modus verwendet und dabei Einzelmassenspuren im Q1 aufgezeichnet. Das Nebulizing-Gas wurde auf 2 l/min eingestellt, das Drying-Gas auf 15 l/min. Die Desolvation Line wurde auf 250 °C geheizt, der Heizblock auf 400 °C.

Screening-System schafft Arbeitserleichterung

Betrachtet man die Ergebnisse des Screenings für einen der Wirkstoffe auf den sechs verschiedenen Phasen, wie in Abbildung 2 dargestellt, wird die bedeutende Arbeitserleichterung durch ein Screening-System sofort ersichtlich. Obwohl alle vier Cellulose-Phasen auf dem gleichen Material basieren, ist die Trennwirkung stark unterschiedlich. Wohingegen auf der Cellulose-2- und Cellulose-4-­Säule keinerlei Trennung der beiden Enantiomere erreicht werden konnte, sind sie bei einer Trennung auf Cellulose-1 und Cellulose-3 gut voneinander getrennt.

Diese ersten Ergebnisse des schnellen Screenings können, wenn nötig, anschließend verwendet werden, um die Analysenergebnisse zu optimieren. Dabei können im Idealfall durch weitere Anpassungen der Parameter, z.B. Gradientenprogramm bzw. Anteil an Modifier bei iso­kratischen Trennungen, Temperatur oder Rückdruck, die Trennleistung verbessert und die Analysendauer weiter reduziert werden. Die Ergebnisse der optimierten Trennungen für die fünf verwendeten pharmazeutischen Wirkstoffe sind in Abbildung 3 zusammengefasst. Für drei der fünf Wirkstoffe war eine Kombination der Cellulose-3-Säule mit 30 % Methanol mit Ameisensäurezusatz als Modifier am besten für die Trennung der Enantiomerenpaare geeignet, für die zwei anderen erwies sich die Cellulose-4-Säule und 30 % reines Methanol als effizient. Für alle Analyten konnte in der photometrischen wie auch in der massenspektrometrischen Detektion ohne Splitting eine Auflösung > 1,5 und eine relative Standardabweichung der Retentionszeit < 2,0 % erzielt werden.

Zuverlässige, robuste und einfache Alternative

Mit dem Nexera-UC-Chiral-Screening-System ist eine automatisierte, schnelle und einfache Methodenentwicklung für chirale pharmazeutische Verbindungen möglich. In einer Sequenz können dabei bis zu elf Säulen und vier verschiedene Modifier getestet werden, um auch bei schwer vorherzusagenden Retentions­mechanismen, wie sie in der chiralen Chromatographie häufig zu finden sind, sicher arbeiten zu können. Im präsentierten Beispiel wurde für fünf chirale pharmazeutische Wirkstoffe innerhalb von zwei Tagen eine schnelle und einfache isokratische SFC-PDA/MS-Methode durch das Screening von sechs Säulen und zwei Modifiern entwickelt und bezüglich analytischer Trennung und Sensitivität optimiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich die SFC-MS als zuverlässige, robuste und einfache Alternative zur Routine-HPLC-Analyse eignet.

* Dr. I. Möller: , Shimadzu Deutschland GmbH, 47269 Duisburg

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