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GC- und LC-Probenvorbereitung So finden Sie die richtige SPE-Kartusche

Die Festphasenextraktion (Solid-Phase-Extraction, SPE) wird häufig eingesetzt, um Proben aufzureinigen und aufzukonzentrieren. Allerdings ist damit ein hoher Arbeitsaufwand verbunden da für verschiedene Analysenmethoden oft unterschiedliche SPE-Materialien eingesetzt werden müssen, um optimale Ergebnisse zu erzielen.

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Abbildung 1: Das GC-MS Chromatogramm vergleicht die SPE mit Silica und mit Polymer-Kationenaustauscher. Die Störsubstanzen vom Polymer sind deutlich zu erkennen (schwarzes Chromatogramm).
Abbildung 1: Das GC-MS Chromatogramm vergleicht die SPE mit Silica und mit Polymer-Kationenaustauscher. Die Störsubstanzen vom Polymer sind deutlich zu erkennen (schwarzes Chromatogramm).
(Bild: ThermoFisher Scientific)

Silica-basierende Materialien liefern saubere Extrakte für die Gaschromatographie und werden hauptsächlich dort verwendet. Der einsetzbare pH-Bereich ist allerdings stark limitiert (pH 3-9). Für die Flüssigchromatographie wird dieses Sorbens eher weniger genutzt, da vom Material stammende Substanzen ionisiert werden und zu Störungen oder Ionensuppression führen.

In der Flüssigchromatographie sind Polymere als Materialien für die Festphasenextraktion gebräuchlicher. Diese liefern im benötigten pH-Bereich saubere Extrakte, können aber wiederum nicht für die GC und GC-MS eingesetzt werden, da sie dort teilweise extreme Störungen verursachen können.

Für manche Analyse sind somit unterschiedliche Adsorptionsmittel erforderlich, wenn im Anschluss Flüssig- und Gaschromatographie durchgeführt werden soll. Abgesehen von Mehrarbeit und Mehrkosten, da die SPE zwei Mal durchgeführt werden müsste, bedeutet das auch einen größeren Aufwand bei Einkaufsprozessen, Lagerhaltung, Validierung etc. und steht dem Streben der Analytiker*Innen nach besten Ergebnissen, Zeiteinsparung, Effizienz und Minimierung von Fehlermöglichkeiten entgegen.

Die Lösung ist eine SPE Kartusche, die für GC- und LC-Methoden gleichermaßen gut geeignet ist.

Neue SPE-Polymermaterialien auch für die Gaschromatographie

Die GC-MS Chromatogramme in Abbildung 1 zeigen den Vergleich von Silica-Material und einem herkömmlichen Polymer für die Probenvorbereitung. Für beide Materialien wurde die gleiche Probenvorbereitung eingesetzt.

Abbildung 1: Das GC-MS Chromatogramm vergleicht die SPE mit Silica und mit Polymer-Kationenaustauscher. Die Störsubstanzen vom Polymer sind deutlich zu erkennen (schwarzes Chromatogramm).
Abbildung 1: Das GC-MS Chromatogramm vergleicht die SPE mit Silica und mit Polymer-Kationenaustauscher. Die Störsubstanzen vom Polymer sind deutlich zu erkennen (schwarzes Chromatogramm).
(Bild: ThermoFisher Scientific)

Die neuen Thermo Scientific SOLA 30 mg/3ml Kartuschen enthalten spezielle Polymere, die sauberste und somit auch für die GC-MS Analyse geeignete Extrakte liefern. GC-MS Chromatogramme wie das in Abbildung 1 gezeigte gehören damit der Vergangenheit an und die Probenvorbereitung wird deutlich vereinfacht. Das Adsorptionsmittel ist ein funktionalisiertes Polymer, das durch seine herausragenden Eigenschaften wie Beladbarkeit des Ionenaustauschers und Sauberkeit der Extrakte aus dem breiten Angebot an SPE-Materialien heraussticht. Das wird durch einen speziellen Reinigungsprozess und eine extrem hohe Oberfläche erzielt. Der pH-Wert reicht, wie bei allen Polymeren, von 0-14 und es werden vom Polymer keine Störsubstanzen eluiert.

Vergleichen Sie Ihre SPE mit den Thermo Scientific SOLA 30mg SPE-Kartuschen:

Das Material ist als hydrophober HRP-Mechanismus (Reversed Phase Polymeric) und als Anionen- sowie Kationentauscher Version in starker und schwacher Form verfügbar. Hiermit werden alle wesentlichen Applikationen im Lebensmittel-, Umwelt- sowie Pharmabereich abgedeckt.

Das GC-MS-Chromatogramm in Abbildung 2 zeigt die Sauberkeit des mit SOLA-SPE gewonnenen Extraktes. Hierbei wurde die Probenvorbereitung von Urin für die Drogenanalyse zu Vergleichszwecken mit SOLA 30 mg/3 ml Kartusche und mit einem Silica-Material mit SCX und C8 verglichen.

Abbildung 2: GC-MS Chromatogramm einer Urinprobe – Vergleich SOLA 30 mg/3ml Polymer (orange) mit Silica SCX Phase (grün)
Abbildung 2: GC-MS Chromatogramm einer Urinprobe – Vergleich SOLA 30 mg/3ml Polymer (orange) mit Silica SCX Phase (grün)
(Bild: ThermoFisher Scientific)

Der Vergleich zeigt auf beeindruckende Weise die Sauberkeit der mit dem SOLA 30 mg Polymer erhaltenen Extrakte auch in der GC-MS. Was bedeutet dies für die Routine im Labor? Es wird nur noch eine Festphasenkartusche benötigt und es spielt somit keine Rolle mehr, ob der Extrakt anschließend mittels GC oder LC analysiert wird. Durch den Einsatz von SOLA sparen Labore erhebliche Kosten, steigern die Effizienz bei gleichzeitiger Verbesserung der analytischen Ergebnisse.

Ein Anwendungsbeispiel aus der Praxis*

Fentanyl gehört zu den Opioiden und wird in der Schmerztherapie in Form von Pflastern verabreicht. Gebrauchte Pflaster enthalten nicht unbeträchtliche Mengen des Wirkstoffs. Eine aktuelle Problematik ist der Missbrauch durch das Kauen von benutzten Fentanylpflastern. Patienten geben diesen Konsum meist nicht an. Hat dieser jedoch stattgefunden, kann es zu starken Entzugserscheinungen kommen, die nicht in Kontext mit den angegebenen konsumierten Substanzen gesetzt werden können. Dies stellt den Analytiker vor ein großes Problem, speziell wenn es um Neuaufnahmen und ein toxikologisches Screening geht.

Fentanyl wird innerhalb von 17 Stunden zur Hälfte über den Urin ausgeschieden, und zwar nur zu 30 % als Fentanyl, zu 70 % als das Stoffwechselprodukt Nor-Fentanyl. Die aktuellen immunlogischen Tests detektieren nur Fentanyl in einem Konzentrationsbereich von 10 ng/ml bis 1 ng/ml, nicht jedoch Nor-Fentanyl.

Um einen eventuellen Beigebrauch zu erkennen ist es notwendig, Fentanyl und Nor-Fentanyl bis zu einer Bestimmungsgrenze von 0.1 ng/ml detektieren zu können. Hierzu bedarf es der Bestimmung der exakten Masse mittels LC-MS. Für die nachfolgende Methode wurde die Thermo Scientific LC Orbitrap MS Technologie eingesetzt.

Die Bestimmung solch geringer Mengen an Analyten ist eine chromatographische Herausforderung. Fentanyl hat einen pKa von 8.3 und Nor-Fentanyl von 10.3. Normalerweise würden beide Analyten bei einem pH von 6 auf der Kartusche angereichert. Es hat sich jedoch herausgestellt, dass Nor-Fentanyl bei diesem pH Wert nicht ausreichend empfindlich detektiert werden kann. Um entsprechende Nachweisgrenzen dafür zu erreichen, muss der pH auf 2 gesenkt werden. Somit scheiden Silica-Materialien in der SPE aus, da diese bei pH Werten unter 3 kollabieren.

Die herkömmlichen polymerischen Materialien zeigten die vorab beschriebenen Probleme. Die Sauberkeit der Extrakte und die Beladbarkeit der Materialien ist nicht hoch genug, um Konzentrationen von 0.1 ng/ml zu bestimmen.

Hier findet nun das neue SOLA SCX Material seinen Einsatz. Tabelle 1 zeigt die unterschiedlichen Belade- und Waschschritte, die getestet wurden.

Methodenentwicklung mit SOLA 30mg/3ml SCX für die Analyse von Fentanyl and Nor-Fentanyl in Urin.
Methodenentwicklung mit SOLA 30mg/3ml SCX für die Analyse von Fentanyl and Nor-Fentanyl in Urin.
(Bild: ThermoFisher Scientific)

Die finale Methode zur Aufreinigung der Proben ist in Abbildung 3 dargestellt.

Abbildung 3: SPE Aufreinigung für Urin auf SOLA 30mg/3 ml SCX
Abbildung 3: SPE Aufreinigung für Urin auf SOLA 30mg/3 ml SCX
(Bild: ThermoFisher Scientific)

Abbildung 4 veranschaulicht die zum Teil auftretenden Ionensuppressions-Effekte für die Analyten. Hierzu wurde ein Urin ohne Konsum von Medikamenten gespiked und mit einem Urin nach erheblichem Medikamentenkonsum verglichen. Wo sich bei 95 % der Proben keine Probleme zeigen, liegen bei gleichzeitig hohem Medikamentenkonsum Ionensuppressions-Effekte vor.

Abbildung 4: LC-MS Daten zur Ionensuppression bei Fentanyl und Nor-Fentanyl und D5
Abbildung 4: LC-MS Daten zur Ionensuppression bei Fentanyl und Nor-Fentanyl und D5
(Bild: ThermoFisher Scientific)

Ein weiterer wichtiger Aspekt zum Thema Ionensuppression ist die Wahl der geeigneten HPLC-Säulenselektivität. Für diese Methodenentwicklung wurden jeweils Säulen mit 100 mm x 2.1 mm ID eingesetzt. Hierbei wurden Thermo Scientific Accucore Biphenyl, Accucore C30, Hypersil GOLD und Acclaim C30 getestet. Nur die Acclaim C30 Säule (200 Ȧ Poren, sphärisches Silica, 13% Kohlenstoffbeladung) war in der Lage die Trennung dahingehend zu beeinflussen, dass alle relevanten Analyten aus der Ionensuppressions-Front geschoben wurden. Hierbei wird mit einem Gradienten, bestehend aus Methanol und Ameisensäure, gearbeitet.

Mit der finalen Methode konnten für Fentanyl- und Nor-Fentanyl die erforderlichen Nachweisgrenzen von 0.1 ng/ml erreicht werden, wie Abbildung 5 für Nor-Fentanyl zeigt.

Abbildung 5: Nachweisgrenze von Nor-Fentanyl bei 0.1 ng/ml, gespikter Urin
Abbildung 5: Nachweisgrenze von Nor-Fentanyl bei 0.1 ng/ml, gespikter Urin
(Bild: ThermoFisher Scientific)

Zusammenfassung

Mit den neuen SOLA 30 mg/3 ml SPE-Kartuschen geht der Wunsch vieler Analytiker*Innen nach einer Vereinfachung der Probenvorbereitung in Erfüllung. Das verwendete SPE-Material liefert einen sehr sauberen Extrakt, der sowohl mit LC-MS UND GC-MS analysiert werden kann. Es muss also nur noch eine SPE pro Probe durchgeführt werden, nicht mehr zwei verschiedene. Dadurch, dass nur noch eine Sorte SPE-Kartuschen benötigt wird, wird der Einkaufsprozess vereinfacht, es gibt weniger Fehlermöglichkeiten, die Validierungsaufwand wird reduziert, und der Arbeitsaufwand für die Probenvorbereitung selbst halbiert.

Das neue SOLA SPE-Material ist vielseitig einsetzbar. In diesem Beitrag wurde ein Beispiel aus dem klinischen Pharmabereich dargestellt, das die exzellente Beladbarkeit unter extremem pH zeigt. Mit keinem anderen getesteten Material wurden vergleichbare Resultate erzielt hinsichtlich der Sauberkeit der Extrakte und der Nachweisgrenzen in der LC-MS.

Die SOLA 30 mg Kartuschen können aber genauso gut im Lebensmittelbereich, beispielsweise für die Analytik von Cannabidiol, THC-COOH, delta9-THC in Lebensmitteln, sowie in der Umweltanalytik eingesetzt werden.

* für Forschung und Entwicklung, nicht für die Diagnostik.

Literatur:

[1] Disposition of toxic drugs and chemicals in Man, eleventh edition, Randall C. Baselt, Biomedical Publications, Seal Beach, California, pages 883-886

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