HPLC / UHPLC So gelingt der sichere Methodentransfer von HPLC auf UHPLC und umgekehrt

Beim Austausch zwischen Forschung und Qualitätskontrolle ist es oft notwendig, die analytischen Methoden zwischen HPLC und UHPLC zu übertragen. Moderne HPLC-Anlagen und Softwaretools unterstützen die Anwender beim Methodentransfer auf andere Systeme.

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In der Pharma- und Lebensmittelindustrie sowie in verschiedenen anderen Branchen ist die High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) immer noch weit verbreitet bei der qualitativen und quantitativen Analyse von Zielverbindungen oder Verunreinigungen. In den letzten Jahren fand aus Gründen der Effizienz- und Durchsatzsteigerung auch die Ultra-High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) Einzug in die Labore.

Der Unterschied zwischen diesen beiden Techniken liegt im maximalen Systemdruck. Durch die höhere Druckstabilität von UHPLC-Instrumenten führen sie Analysen bei ähnlicher Trennleistung in kürzerer Zeit durch. Anwendung finden diese High-End-Geräte vor allem in Forschung und Entwicklung, um neue analytische Methoden möglichst schnell gestalten zu können. Auch in der klinischen Analytik werden sie eingesetzt, um durch die schnellere Analysenzeit den Probendurchsatz und die Geräteauslastung zu erhöhen.

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In vielen Bereichen der Routineanalytik hingegen werden weiterhin normale HPLC-Systeme zur Qualitätskontrolle und -Sicherung verwendet, nicht zuletzt aufgrund ihrer überragenden Robustheit und niedrigeren Wartungskosten. In Laboren, die über beide Arten von Systemen verfügen, werden daher einerseits Methoden von der HPLC auf die UHPLC übertragen, um den Durchsatz zu erhöhen; andererseits werden Methoden, die in der Forschung auf UHPLC-Systemen entwickelt wurden, aus Gründen der Robustheit in der Routineanalytik von der UHPLC zurück auf die HPLC übertragen.

Der Transfer bestehender Methoden zwischen verschiedenen Systemen besteht jedoch nicht nur aus einer einfachen Verkürzung der Analysendauer. Auch Parameter, wie z.B. die Flussrate, das Zeitprogramm und nicht zuletzt die Abmessungen der verwendeten chromatographischen Säule, müssen bei einem Transfer zwischen HPLC und UHPLC modifiziert werden. Ähnliches gilt übrigens auch beim Transfer zwischen Systemen von einem Hersteller auf einen anderen. Ist der Methodentransfer nicht erfolgreich, kann es zu Unterschieden in der Elutionsreihenfolge, der Auflösung und den relativen Retentionszeiten kommen – kurz: die Analysenergebnisse sind nicht miteinander vergleichbar (s. Abb. 1). Welche Parameter sind also zu betrachten?

Parameter für den Methodentransfer – Säulenabmessungen und analytische Bedingungen

Wechselt man von der HPLC zur UHPLC, ist die offensichtlichste Veränderung die Wahl einer UHPLC-geeigneten Säule. Diese Säulen sind kürzer, haben einen schmaleren inneren Durchmesser und eine kleinere Partikelgröße. Doch damit nicht genug: Sind die Säulenabmessungen angepasst, folgen die analytischen Trennbedingungen. Die für die HPLC-Methode optimierten Parameter sind nur begrenzt für die UHPLC-Methode geeignet, ebenso sind die besten Parameter für eine UHPLC-Methode nicht optimal für eine HPLC-Analyse.

Beim Transfer bestehender Methoden zwischen den beiden Systemen sind vor allem folgende Parameter zu beachten:

• Flussrate,

• Zeitprogramm (des Gradienten, Ventil- und Eventschaltung o.ä.),

• Totvolumen des Systems,

• Datenaufnahmerate der Detektoren,

• Injektionsvolumen sowie

• Maximaldruck des Systems.

Eine Anpassung des Zeitprogramms ist vor allem bei der Gradientenanalyse unbedingt notwendig. Verkürzt man die Analysendauer ohne das Zeitprogramm des Gradienten anzupassen, verändert sich die Trennung maßgeblich. Im regulierten Umfeld sind zusätzlich relative Retentionszeiten und Elutionsreihenfolgen oftmals vorgeschrieben, daher muss das Zeitprogramm für einen erfolgreichen Methodentransfer auch hier zwingend angepasst werden.

Der manuelle Transfer von Methoden inklusive der Anpassung aller relevanten Parameter kann daher schnell komplex und zeitaufwendig werden. Um diese Schwierigkeiten zu vermeiden, bieten einige Hersteller von Flüssig-Chromatographie-Systemen Programme zur Umrechnung der nötigen Parameter für einen erfolgreichen Methodentransfer und sogar dezidierte (U)HPLC-Systeme speziell für den Methodentransfer.

Sicherer Methodentransfer in beide Richtungen

Die Nexera-i MT von Shimadzu mit der Labsolutions-Software sind ein Beispiel für die Kombination aus speziellem
(U)HPLC-System und einer Software zur Berechnung der analytischen Bedingungen für den Methodentransfer zwischen HPLC und UHPLC in beide Richtungen. Das System verfügt über zwei separate Flusslinien, eine Linie für HPLC und eine Linie für UHPLC, die nahtlos untereinander gewechselt werden können.

Durch die Kombination von HPLC und UHPLC in einer einzigen Anlage ergeben sich gleich mehrere Vorteile. Zunächst kann die komplette Methodenübertragung in einem einzigen System erfolgen, sodass nur eine Anlage anstelle von zwei einzelnen validiert werden muss. Dadurch verringert sich natürlich auch der Bedarf an Laborplatz und der Wartungsaufwand. Zusätzlich kann durch verschiedene Kits das Systemvolumen so angepasst werden, dass auch die Methodenübertragung zwischen Geräten verschiedener Hersteller durch eine Anpassung des Totvolumens erleichtert wird.

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Die Labsolutions-Software assistiert zusätzlich bei der Umrechnung der Methodenparameter beim Wechsel auf ein neues (U)HPLC-System mit dem eingebauten Methodentransfer-Tool (s. Abb. 2). Dabei werden nach Öffnen der bestehenden Methode für HPLC oder UHPLC lediglich die Abmessungen der alten und der neuen Säule eingegeben sowie die gewünschte resultierende Flussrate. Die übrigen Parameter werden automatisch von der Software errechnet; das Ergebnis kann direkt als neue Methode abgespeichert werden, ohne dass die Parameter manuell neu eingegeben werden müssen.

Praktische Beispiele zum Methodentransfer

• Schnellere Analyse von Cephalosporin-Antibiotika: Cephalosporine sind β-Lactam-Antibiotika zur oralen Dosierung oder Injektion. Im vorliegenden Beispiel wurde für elf Cephalosporine zunächst eine HPLC-Methode etabliert. Mithilfe des Methodentransfer-Tools wurden anschließend die optimalen analytischen Parameter für die UHPLC-Trennung ermittelt. Die Chromatogramme sind zusammen mit den jeweiligen analytischen Trennbedingungen in Abbildung 3 dargestellt. Durch den Wechsel von HPLC auf UHPLC konnte die Analysendauer um den Faktor drei verkürzt werden bei nahezu identischem Elutionsmuster. Während bei der HPLC-Analyse 65 Minuten pro Analyse benötigt werden, kann mittels UHPLC-Trennung ein gleichwertiges Trennergebnis in 17 Minuten erzielt werden.

• Analyse von Sulfonamiden für den Routineeinsatz: Sulfonamide sind eine Gruppe synthetischer antibakterieller Wirkstoffe und Medikamente zur Behandlung von Infektionen und anderen Erkrankungen während einer Chemotherapie. Für diese Analyten wurde jetzt eine UHPLC-Methode auf eine herkömmliche HPLC-Methode übertragen. Die UHPLC-Methode für die Trennung von neun Sulfonamiden wurde mithilfe des Methodentransfer-Tools anhand der neuen Säulendimensionen auf die HPLC-Trennung umgerechnet. Die Chromatogramme und analytischen Trennbedingungen für die jeweiligen Analysen finden sich in Abbildung 4. Durch den Wechsel auf eine deutlich längere Säule mit einem größeren Partikeldurchmesser ergibt sich zwar eine längere Trennung von ca. 20 Minuten anstelle von 5 Minuten in der UHPLC, die Trennung selbst ist aber nahezu identisch.

* Dr. Isabelle Möller: Shimadzu Deutschland GmbH, 47269 Duisburg

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