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Optimierte HPLC So gelingt die nachhaltige und robuste HPLC-Trennungsoptimierung

Autor / Redakteur: Hans-Werner Bilke* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

„Green Chromatography“ – Toxische organische Lösungsmittel vermeiden und die absolute Lösungsmittelmenge verringern sind zwei Ziele dieser nachhaltigeren Arbeitsweise.

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Abb.1: Empirisches Multi-Faktor-/Multi-Zielgrößen-Modell der 7-Faktor-Trennoptimierung
Abb.1: Empirisches Multi-Faktor-/Multi-Zielgrößen-Modell der 7-Faktor-Trennoptimierung
(Bild: Bilke)

Einerseits können Lösungsmittel durch Verringerung der Säulendimensionen (Durchmesser, Säulenlänge) eingespart werden. Andererseits können durch die simultane Trennungsoptimierung in der HPLC-Methodenentwicklung sowohl die Analysezeit als auch die Menge an toxischen Lösungsmittel zielführend optimiert werden. Nur dann kann gleichzeitig die Einhaltung der Selektivität und Robustheit der HPLC-Trennung gewährleistet werden. Die Basis dafür ist ein umfassendes Verständnis des flüssigchromatographischen Trennprozesses und ein definierter Design Space (Method Operable Design Region = MODR) für die HPLC-Trennung.

Der Design Space ist ein unregelmäßiges, sehr komplexes Volumen, das mit einer Matrix von Wahrscheinlichkeiten beschrieben und in einer graphischen Darstellung des resultierenden Bereichs (Fläche oder Volumen) wiedergegeben werden kann.

Chromatographie und statistische Versuchsplanung als Einheit

Die robuste Optimierung der HPLC-Trennung selbst kann mit den Methoden der Versuchsplanung durchgeführt werden, weil anders keine zuverlässigen Aussagen über die größte mögliche zulässige „Operable Design Region“ gemacht werden können. Regulatorische Flexibilität ist für Bewegungen innerhalb des definierten Design Space gewährleistet. Für eine sichere Einschätzung des Design Space benötigt man einen gut strukturierten Ansatz und eine hohe Datenqualität. Die Einheit von Chromatographie und statistischer Versuchsplanung (DoE) ist der effektivste Ansatz, um diese Ziele zu erreichen.

Die Qualität eines nachhaltigen flüssigchromatographischen Trennprozesses hängt von einer Vielzahl von Einflussgrößen und Zielgrößen ab. Wichtige Zielgrößen zur Verringerung der absoluten Lösungsmittelmenge im flüssigchromatographischen Trennprozess sind die Auflösung Rs aller Peakpaare sowie die Retentionszeit des letzten Peaks im Chromatogramm tRmax zur Minimierung der Analysenzeit. Diese Minimierung der Analysenzeit von Routinemethoden bietet ein erhebliches Potenzial zur nachhaltigen Chromatographie im HPLC-Analysenlabor.

Empirisches Multi-Faktor-/Multi-Zielgrößen-Modell

Tab. 1: Signifikante Faktoren und deren Stufen für eine nachhaltige HPLC-Trennoptimierung
Tab. 1: Signifikante Faktoren und deren Stufen für eine nachhaltige HPLC-Trennoptimierung
(Bild: Bilke)

Tab. 2: Zielgrößen Rs und tRmax sowie deren Kriterien für eine nachhaltige HPLC-Trennoptimierung in Abhängigkeit von der Wahl des organischen Lösungsmittels
Tab. 2: Zielgrößen Rs und tRmax sowie deren Kriterien für eine nachhaltige HPLC-Trennoptimierung in Abhängigkeit von der Wahl des organischen Lösungsmittels
(Bild: Bilke)

Eine signifikante Zwei-Faktor-Wechselwirkung AB bedeutet, dass der Effekt des Faktors A auf die betrachtete Zielgröße vom Wert (Stufe) des Faktors B abhängt und umgekehrt, d.h. dass sich A und B sich in ihrer Wirkung auf die Zielgröße gegenseitig beeinflussen, also verstärken oder abschwächen. Da die Schätzung von Wechselwirkungen zwischen den Einflussgrößen und ihr Einfluss auf die Zielgrößen beim Optimieren einer HPLC-Trennung sehr wichtig ist, wurde hier ein Rechtschaffner-Versuchsplan mit 37 Versuchen zur empirischen Beschreibung von Ursache (Einflussgrößen) und Wirkung (Zielgrößen) der simultanen Optimierung von sieben Einflussgrößen (s. Tab. 1) mit zwölf Zielgrößen (s. Tab. 2) verwendet.

Im Folgendem wird die nachhaltige Trennungsoptimierung der HPLC-Methode in Abhängigkeit von den in der Pharma-HPLC wichtigsten Einflussgrößen wie Gradientenzeit tG, Temperatur T, Zusammensetzung organischer Eluent B tC(B2:B1), Startkonzentration Eluent B %Bs, Endkonzentration Eluent B %Be, pH wässriger Eluent A und Flussrate F der Eluenten mittels eines Multi-Faktor-/Multi-Zielgrößen-Modells (s. Abb. 1) vorgestellt.

Robuste Arbeitspunkte der HPLC-Trennungsoptimierung

Tab. 3: Robuster Arbeitspunkt und jeweilige Faktoreinflüsse der globalen Trennoptimierung in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des organischen Eluenten
Tab. 3: Robuster Arbeitspunkt und jeweilige Faktoreinflüsse der globalen Trennoptimierung in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des organischen Eluenten
(Bild: Bilke)

Im Folgendem wird nun die Güte der HPLC-Trennung in Abhängigkeit von der Wahl des organischen Lösungsmittels betrachtet. Die gefundenen robusten Arbeitspunkte (Punkt im Design Space, der in allen möglichen Raumrichtungen die größte Distanz zu den Spezifikationsgrenzen hat) sowie der Einfluss der Faktoren der globalen Trennoptimierung sind in der Tabelle 3 zusammengestellt.

Aus ihr ist zu entnehmen, dass je nach gewähltem Lösungsmittel als organischem Eluent immer unterschiedliche, robuste Arbeitspunkte im Design Space erhalten werden.

Auch der Einfluss des jeweiligen Faktors auf die HPLC-Trennung ist stark abhängig von der Zusammensetzung des Lösungsmittels. Den größten Einfluss auf die HPLC-Trennung weist der Faktor „Eluentzusammensetzung (B2:B1)“ mit 32% beim Einsatz von Acetonitril auf. Für das Lösungsmittelgemisch Acetonitril:Methanol (50Vol.%:50Vol.%) ist neben dem starken Einfluss der Faktoren „Gradientenzeit“ mit 24,3% und „Flussrate“ mit 21% der geringste Einfluss des Faktors „Startkonzentration Eluent B“ mit nur 5% auffallend.

Die berechneten Zielgrößen-Werte Rs und tRmax der Multi-Faktor-/Multi-Zielgrößen-Optimierung sind in Tabelle 4 aufgelistet.

Tab.4: Zielgrößen-Werte der globalen Trennoptimierung in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des organischen Eluenten
Tab.4: Zielgrößen-Werte der globalen Trennoptimierung in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des organischen Eluenten
(Bild: Bilke)

Wie die Werte für die Auflösung Rs zeigen, werden für das jeweilige kritische Peakpaar Rs-Werte ≥I2.6I erhalten. Eine selektive HPLC-Trennung wird somit beim Einsatz des jeweiligen Lösungsmittels im organischen Eluent erreicht. Die Zielgrößenspezifikationen -1,5 ≥ –Rs,krit. oder Rs,krit. ≥ 1,5 und tRmax ≤ 22 min werden sowohl für alle elf Peakpaare als auch für die Retentionszeit des letzten Peaks im Chromatogramm eingehalten.

Visualisierung des Design Space

Aussagen zur Robustheit der nachhaltigen Trennoptimierung können in Form der Grafiken als 2D-Design Space Hypercube und Design Space Range dargestellt werden. Die Abbildungen 2a-c in der Bildergalerie zeigen die Design-Space-Hypercube-Grafiken für die wichtigsten Faktoren pH und tG in Abhängigkeit von der Wahl des organischen Eluenten mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von 1%.

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Wie aus den Abbildungen 2a-c ableitbar, wird mit zunehmenden Austausch der Vol.% an Acetonitril gegen Methanol im organischen Eluenten die Fläche des Design Space Hypercube im experimentellen Bereich immer kleiner, belegbar mit den relativen Volumenwerten von 19.3%, 0.02% und 0.7%.

Für eine umweltfreundlichere chromatographische Trennung ist oft der Einsatz von superkritischem Kohlendioxid als Lösungsmittel empfehlenswert:

Das relative Volumen in der Design-Space-Berechnung ist die Auflösung (Anzahl diskreter Blöcke, in die die untersuchte Design Space Region unterteilt wird) hoch der Anzahl der Faktoren. Gut ist auch in diesen Abbildungen zu erkennen, dass bei Wahl von Acetonitril der größte robuste Hyperwürfel und damit die breitesten Faktorbereiche (Veränderungen der Faktoreinstellung innerhalb des Design Space unter Einhaltung der Zielgrößen-Spezifikationen) ausgewiesen werden. Je mehr Methanol im organischen Eluenten zum Einsatz kommt, desto kleiner ist der robuste Raum in dem man sich unter Einhaltung der Spezifikationen bewegen darf. Diese Tatsache ist in den aus den Design-Space-Hypercube-Grafiken (s. Abb. 3a-c in der Bildergalerie) ableitbaren Spezifikationsgrenzen der bewährten Faktorbereiche für jeden Faktor festgeschrieben.

Fazit: Alle Einflussgrößen sind relevant

Ein nachhaltiges und robustes Optimieren einer HPLC-Trennung ist nur realisierbar, wenn alle signifikanten Einflussgrößen simultan in die Betrachtung einbezogen werden. Die alleinige Änderung einzelner Einflussgrößen bei der Optimierung ist nicht zielführend und neben der Selektivität ist immer die Robustheit der HPLC-Trennung zu belegen.

* Dr. H.-W. Bilke: LC-Pharm-HPLC-Expert Service, 83098 Brannenburg

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